محیط کشت فلچر مدیوم بیس

محیط کشت پایه فلچر (Fletcher Medium Base)

محیط کشت Fletcher Medium Base یک محیط پیچیده حاوی پپتون، عصاره گوشت و عصاره مخمر است که با آگار به مقدار کم (معمولاً ۰.۲٪) برای ایجاد قوام نیمه‌جامد غلیظ شده است. این قوام نیمه‌جامد به لپتوسپیراها، که با حرکت چرخشی و ترجمه‌ای بسیار فعال خود شناخته می‌شوند، اجازه می‌دهد به راحتی در محیط پخش شده و یک ناحیه رشد حلقوی (Doughnut-shaped growth) یا ابری چند سانتیمتر زیر سطح ایجاد کنند (جایی که غلظت اکسیژن بهینه است). این محیط پایه، فاقد سرم خون است که جزء ضروری برای تکمیل محیط می‌باشد. معمولاً پس از استریل‌سازی، ۵ تا ۱۰٪ سرم خرگوش استریل (که حاوی اسیدهای چرب لازم به عنوان منبع کربن و انرژی است) و گاهی هموگلوبین به آن اضافه می‌شود تا محیط کامل Fletcher’s Semisolid Medium حاصل شود. همچنین ممکن است آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند ۵-فلوئورواوراسیل (۵-FU) یا نئومایسین برای مهار آلودگی‌های باکتریایی به آن افزوده گردد.

کاربرد اصلی این محیط در آزمایشگاه‌های تخصصی تشخیصی و تحقیقاتی برای جداسازی لپتوسپیرا از نمونه‌های بالینی (خون، مایع مغزی-نخاعی، ادرار) و نمونه‌های محیطی (آب، خاک) و نیز برای نگهداری و گذر کشت‌های لپتوسپیرا است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: نیمه‌جامد (حاوی آگار کم) پایه برای کشت لپتوسپیرا
• هدف کشت: کشت، جداسازی و نگهداری باکتری‌های جنس Leptospira (عامل لپتوسپیروز)
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده تا حل شود، سپس در لوله‌ها توزیع و اتوکلاو می‌شود. پس از سرد شدن، نیمه‌جامد است).
• ترکیبات کلیدی پایه: پپتون، عصاره گوشت، عصاره مخمر، آگار (مقدار کم، حدود ۰.۲٪)، نمک‌ها.
• افزودنی‌های ضروری برای محیط کامل: سرم خرگوش استریل (۵-۱۰٪) (تأمین‌کننده اسیدهای چرب بلند زنجیره و فاکتورهای رشد)، گاهی هموگلوبین.
• افزودنی‌های انتخابی (برای جداسازی): ۵-فلوئورواوراسیل (۵-FU) یا نئومایسین سولفات، سولفونامیدها (برای مهار فلور باکتریایی همراه).
• شرایط کشت: محیط در لوله‌های بلند (مانند لوله‌های ۱۳x100 mm) به عمق حدود ۵ سانتی‌متر ریخته می‌شود. نمونه (خون، ادرار سانتریفوژ شده، بافت) به عمق حدود ۱ سانتی‌متر زیر سطح محیط تلقیح می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: دمای ۲۸ تا ۳۰ درجه سانتی‌گراد (دمای بهینه برای لپتوسپیرا) به مدت تا ۱۳ هفته (۳ ماه)، با بررسی هفتگی زیر نور برای مشاهده ناحیه رشد.
• خوانش نتیجه: مثبت: تشکیل یک ناحیه رشد حلقوی (ring) یا ابری (haze) کدر چند میلی‌متر تا چند سانتیمتر زیر سطح محیط، که با حرکت لپتوسپیراها ایجاد می‌شود. منفی: عدم تشکیل چنین ناحیه‌ای. آلودگی معمولاً به صورت کدورت یکنواخت یا کلنی‌های جدا در سطح یا عمق ظاهر می‌شود.
• کنترل کیفیت: رشد خوب و تشکیل حلقه مشخص با سویه مرجع لپتوسپیرا مانند Leptospira interrogans serovar Canicola. عدم رشد باکتری‌های معمول در حضور آنتی‌بیوتیک انتخابی.
• کاربرد اصلی: روش استاندارد طلایی برای جداسازی اولیه لپتوسپیرا از نمونه‌های بالینی و محیطی در آزمایشگاه‌های مرجع تشخیص لپتوسپیروز.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه Fletcher Medium Base باید در جای خشک نگهداری شود. پس از اتوکلاو و سرد شدن محیط پایه (که نیمه‌جامد می‌شود)، افزودنی‌های استریل (سرم، آنتی‌بیوتیک) باید در شرایط آسپتیک اضافه شوند. محیط باید در لوله‌های عمیق ریخته شود تا فضای کافی برای تشکیل ناحیه رشد زیر سطحی وجود داشته باشد. بررسی لوله‌ها باید به آرامی و بدون تکان خوردن انجام شود تا ناحیه رشد حلقوی مخدوش نشود. از نور oblique (نور از کنار) برای مشاهده بهتر ناحیه رشد استفاده می‌شود. کشت‌های مثبت باید برای تأیید و سروتیپینگ با روش‌های دیگر (میکروسکوپی زمینه تاریک، آزمایش‌های سرولوژیکی یا مولکولی) بررسی شوند. به دلیل طولانی بودن دوره انکوباسیون، از خشک شدن محیط باید جلوگیری کرد. محصول با کیفیت ایبرسکو (IBRESco)، با فرمولاسیون دقیق، پایه‌ای قابل اعتماد برای تهیه این محیط تخصصی حیاتی برای تشخیص یک بیماری زئونوز مهم فراهم می‌کند.