محیط کشت هاناهان SOB براث 2

محیط کشت براث هاناهان (SOB Broth)

محیط کشت Hanahan’s Broth (SOB Medium) یک محیط اختصاصی برای کارهای زیست‌شناسی مولکولی، به ویژه برای آماده‌سازی سلول‌های مستعد با کارایی بالا در ترانسفورماسیون شیمیایی یا الکتروپوریشن است. فرمولاسیون این محیط توسط داگلاس هاناهان بهینه شد. برخلاف محیط‌های معمولی مانند LB، SOB حاوی عصاره مخمر به جای عصاره گوشت است که منبع غنی‌تری از ویتامین‌ها و نوکلئوتیدها محسوب می‌شود. همچنین، مقادیر دقیقی از منیزیم کلرید (MgCl₂) و منیزیم سولفات (MgSO₄) به آن اضافه شده است. یون‌های منیزیم برای پایداری غشای سلولی و به ویژه برای عملکرد مطلوب در طول شوک حرارتی در پروتکل‌های ترانسفورماسیون شیمیایی حیاتی هستند. این محیط معمولاً با گلوکز نیز غنی می‌شود (تبدیل به محیط SOC) تا پس از شوک حرارتی، یک منبع انرژی سریع برای بازیابی سلول‌های ترانسفورم شده فراهم کند. رشد E. coli در SOB Broth معمولاً منجر به دستیابی به چگالی سلولی بالاتر (OD600 ~0.6-0.8) در فاز لگاریتمی و سلامت بهتر سلول‌ها نسبت به LB می‌شود.

کاربرد اصلی این محیط منحصراً در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی زیست‌فناوری و ژنتیک مولکولی برای تولید سلول‌های مستعد با کارایی فوق‌العاده بالا، رشد باکتری‌ها قبل از استخراج پلاسمید با کیفیت بالا و نیز در پروتکل‌های کلونینگ دقیق است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث)، غنی‌شده و تخصصی برای زیست‌شناسی مولکولی
• هدف کشت: رشد با چگالی بالا و سالم E. coli برای تولید سلول‌های مستعد (Competent Cells) و کاربردهای کلونینگ
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی تریپتون، عصاره مخمر، کلرید سدیم، کلرید منیزیم و سولفات منیزیم) که پس از حل کردن در آب مقطر و اتوکلاو استفاده می‌شود. گلوکز به صورت جداگانه استریل شده و اضافه می‌گردد (برای تهیه SOC Broth).
• ترکیبات کلیدی: تریپتون، عصاره مخمر، کلرید سدیم (NaCl)، کلرید منیزیم (MgCl₂)، سولفات منیزیم (MgSO₄)
• ویژگی متمایزکننده: حضور غلظت بهینه یون منیزیم (Mg²⁺) و عصاره مخمر که در مجموع سلامت غشا، کارایی ترانسفورماسیون و رشد سریع را افزایش می‌دهند.
• شرایط کشت: معمولاً در فلاسک‌های ارلن‌مایر با حجم مناسب (نسبت ۱:۵ تا ۱:۱۰ حجم محیط به حجم فلاسک) و تحت شرایط شیکر با سرعت بالا (۲۵۰-۳۰۰ دور در دقیقه) برای هوادهی عالی کشت داده می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: ۳۷ درجه سانتی‌گراد، معمولاً به مدت ۳-۴ ساعت (تا رسیدن به OD600 بین ۰.۴ تا ۰.۸ برای تهیه سلول مستعد) یا طی شب (Overnight) برای کشت معمولی.
• خوانش نتیجه: رشد به صورت کدورت یکنواخت و شدید اندازه‌گیری می‌شود. موفقیت نهایی با کارایی ترانسفورماسیون (تعداد کلونی تشکیل‌شده در هر میکروگرم DNA) سنجیده می‌شود که با استفاده از این محیط به طور قابل توجهی افزایش می‌یابد.
• کنترل کیفیت: سویه Escherichia coli DH5α یا دیگر سویه‌های رایج کلونینگ: باید به چگالی نوری بالا (OD600 > 2.۰) در کشت طی شب دست یابد و پس از فرآیند مستعدسازی، کارایی ترانسفورماسیون بالا (مثلاً > ۱×۱۰⁸ cfu/µg DNA برای روش شیمیایی) را نشان دهد.
• کاربرد اصلی: محیط اختصاصی و استاندارد برای آماده‌سازی سلول‌های مستعد شیمیایی و الکتروپوریشن E. coli در تکنیک‌های کلونینژن، ساخت کتابخانه و بیان پروتئین نوترکیب.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر محیط SOB Broth ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و خنک نگهداری کنید. برای تهیه، پودر را در آب مقطر یون‌زدایی‌شده (Deionized) با کیفیت بالا حل کنید. کلرید منیزیم و سولفات منیزیم اغلب به صورت جداگانه به محیط پایه (بدون منیزیم) اضافه می‌شوند یا در فرمول پودری گنجانده شده‌اند. دقت کنید که محیط حاوی منیزیم را نباید اتوکلاو کرد، زیرا منیزیم تحت حرارت بالا می‌تواند رسوب دهد. معمولاً محیط پایه (بدون منیزیم) اتوکلاو شده و سپس محلول استریل فیلترشده کلرید منیزیم و سولفات منیزیم به آن اضافه می‌شود. برای تهیه SOC Broth (که برای بازیابی سلول‌های ترانسفورم‌شده استفاده می‌شود)، محلول استریل گلوکز ۲۰٪ نیز پس از سرد شدن محیط، به غلظت نهایی ۲۰ میلی‌مولار اضافه می‌گردد. تمام افزودنی‌ها باید استریل و فیلتر شده باشند. برای کشت جهت تهیه سلول مستعد، از یک کشت اولیه تازه (Overnight) استفاده شده و با رقت ۱:۱۰۰ تا ۱:۲۰۰ در حجم مناسب محیط تازه تلقیح می‌شود. رشد در شیکر با سرعت بالا و دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد تا رسیدن به OD600 مطلوب (~۰.۵-۰.۶ برای روش‌های شیمیایی) ادامه می‌یابد. سپس بلافاصله کشت روی یخ قرار می‌گیرد تا متابولیسم متوقف شود. محیط‌های آماده SOB/SOC را می‌توان در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد برای چند هفته نگهداری کرد. برای بهترین نتایج در ترانسفورماسیون، استفاده از محیط تازه و مراحل سرد کردن سریع (Chilling) دقیقاً رعایت شود.