محیط کشت هکتون انتریک آگار 2

محیط کشت آگار هکتون انتریک (Hektoen Enteric Agar)

محیط کشت Hektoen Enteric Agar یک محیط انتخابی-تشخیصی است که با استفاده از نمک‌های صفراوی و رنگ‌های مختلف (بایل‌سالts No. 3 و Green) رشد باکتری‌های گرم‌مثبت و بسیاری از گرم‌منفی‌های روده‌ای غیربیماری‌زا را مهار می‌کند. وجه تشخیصی این محیط مبتنی بر سه تست بیوشیمیایی است: تخمیر لاکتوز/ساکاروز، تولید سولفید هیدروژن (H₂S) و قدرت احیایی. این محیط حاوی لاکتوز و ساکاروز به عنوان منابع کربوهیدرات، تیوسولفات سدیم به عنوان پیش‌ماده تولید H₂S، و نمک‌های آهن آمونیوم سیترات برای تشخیص H₂S است. نشانگر pH بروموتیمول بلو و اسید فوشین نیز در محیط وجود دارند. باکتری‌هایی که هر یک از قندها را تخمیر کنند (مانند E. coli و بسیاری از انتروباکتریاسه‌های غیربیماری‌زا)، اسید تولید کرده و کلونی‌های آنها به رنگ نارنجی-صورتی یا زرد درمی‌آید. در مقابل، سالمونلا و شیگلا معمولاً این قندها را تخمیر نمی‌کنند و در نتیجه از آمینه‌های محیط استفاده کرده و محیط را قلیایی می‌کنند، که منجر به تشکیل کلونی‌های سبز-آبی یا سبز می‌شود. علاوه بر این، سویه‌های سالمونلا که H₂S تولید می‌کنند (مانند S. Typhi و بسیاری از سروتیپ‌ها)، مرکز کلونی سیاه رنگ خواهند داشت (به دلیل تشکیل سولفید آهن).

کاربرد اصلی این محیط در آزمایشگاه‌های تشخیصی بالینی و میکروبیولوژی غذایی برای غربالگری نمونه‌های مدفوع و مواد غذایی از نظر وجود سالمونلا و شیگلا است. این محیط بخشی از پروتکل استاندارد ISO و FDA/BAM محسوب می‌شود.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، انتخابی-تشخیصی برای سالمونلا و شیگلا
• هدف کشت: جداسازی و افتراق اولیه سالمونلا و شیگلا از سایر انتروباکتریاسه‌های روده‌ای
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی پپتون، لاکتوز، ساکاروز، نمک‌های صفراوی، رنگ‌ها، تیوسولفات و نمک آهن) که پس از حل کردن در آب مقطر و اتوکلاو، در پلیت ریخته می‌شود.
• ترکیبات کلیدی: پپتون، لاکتوز، ساکاروز، نمک‌های صفراوی، بروموتیمول بلو، اسید فوشین، تیوسولفات سدیم، آهن آمونیوم سیترات
• اصول تشخیصی: ۱) رنگ کلونی: تخمیرکننده‌ها: نارنجی/صورتی/زرد. غیرتخمیرکننده‌ها (سالمونلا/شیگلا): سبز/آبی. ۲) تولید H₂S: با مرکز یا کل کلونی سیاه رنگ نشان داده می‌شود.
• شرایط کشت: پس از غنی‌سازی نمونه (مثلاً در GN Broth یا Selenite Broth)، از کشت به روش خطی یا Spread روی سطح پلیت استفاده می‌شود تا کلونی‌های مجزا به دست آید.
• شرایط انکوباسیون: ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت. برای برخی سویه‌های کندرشد شیگلا، ممکن است بررسی در ۴۸ ساعت نیز لازم باشد.
• خوانش نتیجه: سالمونلا (H₂S مثبت): کلونی سبز-آبی با مرکز سیاه. سالمونلا (H₂S منفی): کلونی سبز-آبی بدون مرکز سیاه. شیگلا: کلونی سبز (بدون مرکز سیاه). انتروباکتریاسه‌های غیربیماری‌زا (مانند E. coli): کلونی نارنجی-صورتی تا زرد (گاهی با رسوب زرد اطراف کلونی).
• کنترل کیفیت: سویه Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028: کلونی سبز با مرکز سیاه. سویه Shigella flexneri ATCC 12022: کلونی سبز. سویه Escherichia coli ATCC 25922: کلونی نارنجی-زرد.
• کاربرد اصلی: محیط انتخابی-تشخیصی استاندارد برای غربالگری سالمونلا و شیگلا در نمونه‌های مدفوع، غذایی و محیطی در آزمایشگاه‌های تشخیصی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر محیط Hektoen Enteric Agar ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و خنک و دور از نور نگهداری کنید. برای تهیه، پودر را در آب مقطر حل کرده و با حرارت ملایم به جوش آورید (تا کاملاً محلول شود). از جوشاندن طولانی‌مدت خودداری کنید. محیط را طبق دستور اتوکلاو نمایید (معمولاً در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه). پس از اتوکلاو، محیط را در حمام آب ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد نگه داشته و بلافاصله در پلیت بریزید. پلیت‌های آماده را می‌توان در کیسه‌های پلاستیکی بسته‌بندی و در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و دور از نور برای حداکثر ۴ هفته نگهداری کرد. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق رسیده و سطح آنها خشک باشد. این محیط به تنهایی برای تشخیص قطعی کافی نیست و کلونی‌های مشکوک (سبز یا با مرکز سیاه) باید برای تأیید نهایی و تعیین سروتیپ، روی محیط‌های بیوشیمیایی مناسب (مانند TSI، LIA، MIU) و تست‌های سرولوژی زیرکشت داده شوند. برخی سویه‌های Proteus نیز ممکن است کلونی‌های سبز با مرکز سیاه ایجاد کنند که باید با تست اوره از سالمونلا افتراق داده شوند. برخی سویه‌های شیگلا می‌توانند به آرامی لاکتوز را تخمیر کنند و رنگ کلونی پس از ۴۸ ساعت به نارنجی متمایل شود، بنابراین خوانش در ۲۴ ساعت حیاتی است. برای نمونه‌های غذایی، حتماً از مرحله پیش‌غنی‌سازی و غنی‌سازی انتخابی قبل از کشت روی HE Agar استفاده شود.