محیط کشت پالکام آگار بیس

محیط کشت آگار پالکام (PALCAM Agar)

محیط کشت PALCAM Agar یک محیط انتخابی-تشخیصی است که بر اساس استانداردهای بین‌المللی مانند ISO 11290 برای جداسازی Listeria monocytogenes توصیه شده است. این محیط از چندین عامل برای مهار فلور همراه استفاده می‌کند: لیتیم کلرید، پلی‌میکسین B، سفالوتین (اسفالتین) و اکولین. پلی‌میکسین B و سفالوتین به ترتیب باکتری‌های گرم‌منفی و گرم‌مثبت (به جز لیستریا) را مهار می‌کنند. جزء تشخیصی کلیدی، اکولین است که توسط اکثر گونه‌های لیستریا (به جز L. ivanovii) هیدرولیز می‌شود. هیدرولیز اکولین به اسکولین و گلوکز، در حضور نمک‌های آهن (آهن III آمونیوم سیترات) در محیط، منجر به تشکیل یک رنگ سیاه در اطراف یا زیر کلونی‌ها می‌شود. نشانگر دیگر، مانیتول است. Listeria monocytogenes مانیتول را تخمیر نمی‌کند، در حالی که L. ivanovii (که به ندرت در غذا یافت می‌شود) مانیتول-مثبت است. محیط همچنین حاوی فنول رد به عنوان نشانگر pH است. عدم تخمیر مانیتول توسط L. monocytogenes باعث می‌شود محیط قلیایی باقی بماند و کلونی‌ها روی زمینه خاکستری-سبز دیده شوند.

کاربرد اصلی این محیط در صنایع غذایی و آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت برای شناسایی مستقیم و احتمالی Listeria spp. و L. monocytogenes پس از مرحله غنی‌سازی (مانند استفاده از Fraser Broth) است. کلونی‌های مشکوک سپس با تست‌های تأییدی بیشتر شناسایی می‌شوند.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، انتخابی-تشخیصی برای لیستریا
• هدف کشت: جداسازی و شناسایی اولیه Listeria monocytogenes و سایر گونه‌های لیستریا از نمونه‌های غذایی
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی پپتون، عصاره مخمر، مانیتول، اکولین، نمک‌های آهن، لیتیم کلرید و آگار) که پس از حل کردن و اتوکلاو، قبل از ریختن در پلیت، آنتی‌بیوتیک‌های استریل (پلی‌میکسین B، سفالوتین، اسید نالیدیکسیک) اضافه می‌شود.
• ترکیبات کلیدی پایه: پپتون، عصاره مخمر، مانیتول، اکولین، آهن (III) آمونیوم سیترات، لیتیم کلرید، فنول رد، آگار
• مکمل انتخابی (PALCAM Supplement): پلی‌میکسین B، سفالوتین (اسفالتین)، اسید نالیدیکسیک
• اصول تشخیصی: ۱) هیدرولیز اکولین: ایجاد رنگ سیاه در اطراف کلونی. ۲) تخمیر مانیتول: عدم تخمیر توسط L. monocytogenes (کلونی روی زمینه خاکستری-سبز). گونه‌های مانیتول-مثبت کلونی‌های زرد ایجاد می‌کنند.
• شرایط کشت: پس از مرحله غنی‌سازی، از کشت به روش خطی یا Spread روی سطح پلیت استفاده می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: ۳۰ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت. لیستریا معمولاً پس از ۲۴ ساعت به صورت کلونی‌های کوچک دیده می‌شود.
• خوانش نتیجه: لیستریا مونوسیتوژنز (احتمالی): کلونی‌های خاکستری-سبز با حلقه سیاه نازک (هاله) در اطراف آنها (ناشی از هیدرولیز اکولین). لیستریا ایوانووی: کلونی‌های زرد (تخمیر مانیتول) با حلقه سیاه. منفی: عدم رشد یا رشد کلونی‌هایی که حلقه سیاه ایجاد نمی‌کنند.
• کنترل کیفیت: سویه Listeria monocytogenes ATCC 19115: رشد خوب با کلونی‌های خاکستری-سبز و هاله سیاه. سویه Listeria ivanovii ATCC 19119: کلونی‌های زرد با هاله سیاه. سویه Escherichia coli ATCC 25922: مهار رشد.
• کاربرد اصلی: روش استاندارد انتخابی برای جداسازی و شناسایی اولیه Listeria monocytogenes در میکروبیولوژی غذایی مطابق با استاندارد ISO.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه Palcam Agar Base و مکمل خشک آن از ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و زیر ۸ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید. مکمل (حاوی آنتی‌بیوتیک‌ها) حساس به حرارت است و نباید اتوکلاو شود. پس از اتوکلاو و خنک شدن محیط پایه به ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد، محلول استریل فیلترشده مکمل را اضافه کرده، به آرامی مخلوط کنید و بلافاصله در پلیت بریزید. پلیت‌های آماده را می‌توان در کیسه‌های پلاستیکی بسته‌بندی و در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و دور از نور برای مدت محدود (حداکثر ۱ هفته) نگهداری کرد. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق رسیده و سطح آنها خشک باشد. این محیط معمولاً پس از یک مرحله غنی‌سازی (مثلاً با Fraser Broth) استفاده می‌شود. کلونی‌های مشکوک (خاکستری-سبز با هاله سیاه) باید برای تأیید نهایی با تست‌های بیوشیمیایی (کاتالاز، حرکت، همولیز روی خون آگار، تست قندها) و اگر لازم باشد تست‌های مولکولی، زیرکشت داده شوند. هاله سیاه ممکن است در زیر کلونی واضح‌تر باشد، بنابراین بررسی کلونی از زیر پلیت نیز مفید است. برخی استرپتوکوک‌ها و انتروکوک‌ها نیز ممکن است اکولین را هیدرولیز کنند، اما معمولاً به دلیل عوامل انتخابی مهار می‌شوند یا مورفولوژی کلونی متفاوتی دارند. دوره انکوباسیون بیش از ۴۸ ساعت ممکن است باعث رشد باکتری‌های مقاوم شود.