محیط کشت PPLO براث

محیط کشت براث پی‌پی‌ال‌او (مایکوپلاسما براث پایه)

محیط کشت PPLO Broth (Pleuropneumonia-Like Organisms Broth) یا Mycoplasma Broth Base، فرم مایع محیط PPLO Agar است. این محیط پایه حاوی عصاره قلب و پپتون به عنوان منابع پیچیده آمینواسیدها، پپتیدها، ویتامین‌ها و مواد معدنی است. برای رشد موفقیت‌آمیز مایکوپلاسماها، افزودن سرم (معمولاً ۱۰-۲۰٪ سرم اسب یا سرم جنین گاوی) به این پایه ضروری است. سرم منبع حیاتی استرول‌ها (مانند کلسترول) و اسیدهای چرب بلند زنجیره است که مایکوپلاسماها به دلیل فقدان مسیرهای سنتزی، باید آنها را از محیط جذب کنند. همچنین اغلب مخمر استخراج (Yeast Extract) و DNA به عنوان منابع اضافی نوکلئوتید و فاکتورهای رشد اضافه می‌شود. به دلیل عدم وجود دیواره سلولی، آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند پنی‌سیلین G یا آمپی‌سیلین به محیط اضافه می‌گردد تا از رشد باکتری‌های دارای دیواره و آلودگی‌های رایج جلوگیری شود. برای کشت اوره‌آپلاسماها که آنزیم اوره‌آز تولید می‌کنند، اوره و یک نشانگر pH (مانند فنول رد) نیز به محیط افزوده می‌شود.

کاربرد اصلی این محیط در آزمایشگاه‌های تشخیصی بالینی برای کشت مایکوپلاسما از نمونه‌های دستگاه تناسلی، تنفسی و سایر مایعات بدن، در تحقیقات، و به ویژه در صنعت کشت سلولی برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسمایی بانک‌های سلولی و محصولات بیولوژیک است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث)، غنی‌شده و تخصصی برای مایکوپلاسما و اوره‌آپلاسما
• هدف کشت: کشت و تکثیر مایکوپلاسماها و اوره‌آپلاسماها در فاز مایع برای تشخیص، مطالعات یا تولید آنتی‌ژن
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی عصاره قلب، پپتون و نمک‌ها) که پس از حل کردن، اتوکلاو و خنک شدن، با سرم و سایر افزودنی‌های استریل مخلوط می‌شود.
• ترکیبات کلیدی پایه: عصاره قلب، پپتون، کلرید سدیم
• غنی‌سازهای ضروری: سرم استریل (۱۰-۲۰٪) (منبع استرول و اسیدهای چرب)، مخمر استخراج، DNA، پنی‌سیلین G (مهارکننده باکتری‌های دارای دیواره)
• افزودنی برای اوره‌آپلاسما: اوره و فنول رد (تغییر رنگ به قرمز/بنفش در صورت هیدرولیز اوره)
• اصول عملکرد: تأمین تمامی نیازهای پیچیده تغذیه‌ای مایکوپلاسماها از جمله استرول، اسیدهای چرب، پیش‌سازهای نوکلئیک اسید و اسیدهای آمینه در فرم مایع.
• شرایط کشت: نمونه مستقیماً به ویال یا لوله حاوی محیط مایع اضافه می‌شود. اغلب از محیط مایع برای غنی‌سازی اولیه قبل از کشت روی محیط جامد استفاده می‌گردد.
• شرایط انکوباسیون: در اتمسفر حاوی ۵-۱۰٪ CO₂ با رطوبت بالا، در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ تا ۱۴ روز یا بیشتر. برخی گونه‌ها ممکن است نیاز به شرایط بیهوازی داشته باشند.
• خوانش نتیجه: رشد در محیط مایع ممکن است به صورت کدورت بسیار ظریف، تغییر رنگ (در صورت وجود نشانگر اوره) یا تغییر در شاخص pH (قلیایی شدن) مشاهده شود. تشخیص قطعی رشد اغلب با زیرکشت روی محیط جامد PPLO Agar و مشاهده کلونی‌های مشخص “تخم مرغ نیمرو” تأیید می‌شود.
• کنترل کیفیت: سویه Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531: رشد خوب در محیط مایع پس از ۵-۱۰ روز که با زیرکشت روی جامد تأیید می‌شود. سویه Ureaplasma urealyticum ATCC 27618: تغییر رنگ محیط به قرمز (هیدرولیز اوره مثبت).
• کاربرد اصلی: محیط مایع برای غنی‌سازی و تشخیص مایکوپلاسما در نمونه‌های بالینی، پایش آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی و تحقیقات پایه روی این میکروارگانیسم‌ها.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه PPLO Broth ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و خنک نگهداری کنید. تمام افزودنی‌های حساس به حرارت (سرم، مخمر استخراج، DNA، آنتی‌بیوتیک‌ها، اوره) باید استریل فیلتر شده و پس از اتوکلاو و خنک شدن محیط پایه به دمای اتاق، اضافه شوند. محیط آماده شده را می‌توان در ویال‌های کوچک تقسیم کرد تا از تبخیر و تغییر pH در طول انکوباسیون طولانی جلوگیری شود. قبل از استفاده، محیط باید به دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد برسد. نمونه‌های بالینی باید بلافاصله یا در محیط انتقال مخصوص به آزمایشگاه منتقل شوند. حجم نمونه اضافه شده به محیط معمولاً کم (۰.۱-۰.۲ میلی‌لیتر به ۱۰ میلی‌لیتر محیط) است. انکوباسیون طولانی مدت (تا ۱۴ روز یا بیشتر) ضروری است، زیرا رشد مایکوپلاسما کند است. محیط باید روزانه از نظر تغییر رنگ (برای اوره‌آپلاسما) یا هرگونه کدورت بررسی شود. برای تأیید رشد، در روزهای ۳، ۷ و ۱۴، مقداری از محیط را روی پلیت PPLO Agar جامد زیرکشت دهید. کار در شرایط استریل بسیار مهم است زیرا آلودگی‌های باکتریایی یا قارچی می‌تواند به سرعت در این محیط غنی رشد کند. برای کشت سلولی، نمونه‌های مشکوک به آلودگی مستقیماً به این محیط تلقیح می‌شوند. این محیط می‌تواند برای تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی مایکوپلاسما نیز به کار رود.