محیط کشت سیمونز سیترات آگار 2

محیط کشت آگار سیترات سیمونز (Simmons Citrate Agar)

محیط کشت Simmons Citrate Agar یک محیط حداقل (Minimal Medium) تعریف‌شده است که حاوی سیترات سدیم به عنوان تنها منبع کربن، فسفات آمونیوم به عنوان تنها منبع نیتروژن، و نمک‌های معدنی ضروری است. این محیط فاقد هرگونه منبع کربن یا نیتروژن آلی پیچیده (مانند پپتون یا عصاره گوشت) می‌باشد. شاخص pH به نام برموتیمول بلو به محیط اضافه شده که در pH اسیدی زرد و در pH قلیایی آبی می‌شود. اگر باکتری قادر به متابولیزه کردن سیترات باشد، آن را از محیط جذب کرده و به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده می‌کند. در طی این فرآیند، باکتری آمونیوم فسفات را نیز به عنوان منبع نیتروژن مصرف می‌کند و باعث آزادسازی آمونیاک و سایر ترکیبات قلیایی می‌گردد. این امر منجر به قلیایی شدن محیط و تغییر رنگ شاخص از سبز (خنثی) به آبی پررنگ می‌شود. عدم تغییر رنگ (یا زرد شدن) نشان‌دهنده عدم توانایی در استفاده از سیترات است. محیط به صورت شیب دار (Slant) در لوله آماده می‌شود تا هم سطح مایل و هم عمق محیط (Butt) قابل مشاهده باشد.

این تست به طور گسترده در میکروبیولوژی تشخیصی برای افتراق بین اعضای خانواده انتروباکتریاسه استفاده می‌شود. به عنوان مثال، Escherichia coli معمولاً سیترات منفی است، در حالی که Klebsiella pneumoniae و Enterobacter aerogenes سیترات مثبت هستند. این تست بخشی از مجموعه استاندارد IMViC (ایندول، متیل رد، Voges-Proskauer، سیترات) برای شناسایی این گروه باکتریایی است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، تعریف‌شده (Defined)، حداقل (Minimal)، افتراقی بر اساس متابولیسم کربن.
• هدف کشت: تشخیص توانایی باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن و انرژی (تست سیترات).
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود، سپس در لوله ریخته و به صورت شیب دار (Slant) منعقد شده و اتوکلاو می‌شود).
• ترکیبات کلیدی: سیترات سدیم (تنها منبع کربن)، فسفات آمونیوم (تنها منبع نیتروژن)، نمک‌های معدنی (منیزیم، پتاسیم، سدیم)، برموتیمول بلو (شاخص pH: زرد در pH <6.0، سبز در pH ~7.0، آبی در pH >۷.۶).
• مکانیسم عمل: باکتری‌های دارای سیستم حمل و نقل سیترات و آنزیم سیترات‌لیاز (Citrase) می‌توانند سیترات را وارد سلول کرده و در چرخه اسید سیتریک یا سایر مسیرها متابولیزه کنند. مصرف یون آمونیوم و تولید ترکیبات قلیایی، pH را افزایش داده و باعث تغییر رنگ شاخص به آبی می‌شود.
• شرایط کشت: کشت با یک اینوکولوم سبک (از یک کلونی یا کشت مایع) به صورت خطی بر روی سطح شیبدار (Slant) و همچنین استاب (Stab) به داخل عمق (Butt) محیط.
• شرایط انکوباسیون: ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت (گاهی تا ۹۶ ساعت برای گونه‌های کند).
• خوانش نتیجه: سیترات مثبت: تغییر رنگ واضح محیط از سبز به آبی پررنگ (در سطح شیبدار و/یا عمق). ممکن است همراه با رشد قابل مشاهده (کدورت در عمق) باشد. سیترات منفی: عدم تغییر رنگ (محیط سبز باقی می‌ماند) یا زرد شدن. معمولاً رشد قابل توجهی دیده نمی‌شود.
• کنترل کیفیت: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883: رشد خوب و تغییر رنگ به آبی (مثبت). Escherichia coli ATCC 25922: عدم تغییر رنگ (منفی).
• کاربرد اصلی: تست سیترات در مجموعه شناسایی انتروباکتریاسه (IMViC)، افتراق بین E. coli (معمولاً منفی) و Klebsiella/Enterobacter (معمولاً مثبت)، و کمک به شناسایی سایر باکتری‌های گرم منفی بر اساس الگوی استفاده از منابع کربن.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Simmons Citrate Agar محصول ایبرسکو (IBRESco) باید در جای خشک و خنک نگهداری شود. برای تهیه، پودر را در آب مقطر حل کرده و با حرارت هم بزنید تا کاملاً شفاف شود. سپس در لوله‌های کشت ریخته و به صورت شیب‌دار (Slant) با عمق کافی (Butt) منعقد کنید. پس از اتوکلاو، لوله‌ها را در حالت شیب‌دار سرد نمایید. محیط آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. قبل از کشت، لوله‌ها نباید رطوبت اضافی روی سطح داشته باشند. اینوکولوم باید سبک باشد؛ استفاده از اینوکولوم سنگین ممکن است مواد آلی را به محیط منتقل کرده و باعث نتیجه مثبت کاذب شود. کشت باید هم بر سطح شیبدار و هم در عمق انجام شود. پس از انکوباسیون، نتیجه را بر اساس تغییر رنگ (نه صرفاً رشد) بخوانید. برخی از گونه‌ها (مانند برخی Salmonella) ممکن است تنها در عمق (Butt) آبی شوند. رشد ضعیف بدون تغییر رنگ به معنای منفی است. انکوباسیون تا ۴ روز ممکن است برای برخی باکتری‌های کند لازم باشد. توجه داشته باشید که برخی محیط‌های سیترات دیگر (مانند کوزر) فرمولاسیون متفاوتی دارند و نتایج لزوماً قابل تعمیم نیستند. این تست یکی از قابل اعتمادترین تست‌های بیوشیمیایی در نظر گرفته می‌شود. همیشه از کنترل‌های مثبت و منفی استفاده کنید.