محیط کشت اسکیم میلک آگار 2

محیط کشت آگار شیر بدون چربی (Skim Milk Agar)

محیط کشت Skim Milk Agar یک محیط نسبتاً ساده است که از ترکیب آگار و شیر بدون چربی (Skim Milk) پودر شده یا مایع تشکیل شده است. شیر بدون چربی منبع غنی از پروتئین کازئین است که یک سوبسترای اصلی برای آنزیم‌های پروتئولیتیک خارج سلولی (اکزوپروتئازها) محسوب می‌شود. مکانیزم این محیط بر پایه هیدرولیز کازئین توسط میکروارگانیسم است. اگر میکروارگانیسم مورد آزمایش آنزیم‌های پروتئولیتیک (مانند کازئیناز) تولید کند، این آنزیم‌ها کازئین موجود در محیط را که به صورت کلوئیدی باعث کدری و مات بودن محیط می‌شود، تجزیه می‌کنند. تجزیه کازئین به پپتیدها و اسیدهای آمینه کوچک‌تر و محلول، منجر به ایجاد یک هاله شفاف (Zone of Clearing) در اطراف کلونی یا خط کشت در محیط مات می‌گردد. عدم تشکیل هاله شفاف نشان‌دهنده عدم فعالیت پروتئولیتیک است. این محیط غیرانتخابی است و رشد طیف وسیعی از باکتری‌ها و قارچ‌ها را پشتیبانی می‌کند، بنابراین معمولاً از کشت خالص استفاده می‌شود.

کاربرد اصلی آن در میکروبیولوژی غذایی (برای بررسی فساد پروتئینی توسط میکروارگانیسم‌ها)، میکروبیولوژی صنعتی (غربالگری سویه‌های تولیدکننده پروتئاز برای کاربردهای بیوتکنولوژی)، میکروبیولوژی تشخیصی (به عنوان یک تست بیوشیمیایی برای شناسایی برخی باکتری‌ها، مانند برخی Bacillus spp. یا Pseudomonas spp.) و تحقیقات میکروبی است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، غیرانتخابی، افتراقی بر اساس فعالیت آنزیمی.
• هدف کشت: تشخیص تولید آنزیم‌های پروتئولیتیک خارج سلولی، به ویژه کازئیناز، توسط میکروارگانیسم‌ها.
• حالت فیزیکی: پودر (شامل آگار و پودر شیر بدون چربی) یا به صورت پایه آگار که پس از اتوکلاو، شیر استریل فیلترشده به آن اضافه می‌شود. محیط نهایی مات و شیری رنگ است.
• ترکیبات کلیدی: پودر شیر بدون چربی (منبع کازئین و مواد مغذی جزئی)، آگار (جامدکننده). ممکن است حاوی پپتون یا عصاره مخمر نیز باشد.
• مکانیسم عمل: هیدرولیز پروتئین کازئین (سوبسترای مات) به محصولات محلول و کوچک توسط آنزیم‌های پروتئولیتیک ترشح‌شده میکروارگانیسم، که منجر به شفاف شدن محیط در ناحیه فعالیت آنزیم می‌شود.
• شرایط کشت: کشت نقطه‌ای (برای کلونی) یا خطی بر روی سطح پلیت. استفاده از کشت خالص ضروری است.
• شرایط انکوباسیون: بسته به میکروارگانیسم: برای باکتری‌ها معمولاً ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت؛ برای قارچ‌ها ممکن است دمای پایین‌تر (۲۵-۳۰ درجه) و زمان طولانی‌تر (تا ۵ روز) نیاز باشد.
• خوانش نتیجه: پروتئولیتیک مثبت (کازئیناز مثبت): وجود یک هاله شفاف واضح در اطراف کلونی یا خط کشت در محیط مات. پروتئولیتیک منفی (کازئیناز منفی): عدم وجود هاله شفاف. محیط زیر و اطراف کلونی همچنان مات باقی می‌ماند.
• کنترل کیفیت: سویه Bacillus subtilis ATCC 6633 یا Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: تشکیل هاله شفاف (مثبت). سویه Escherichia coli ATCC 25922: عدم تشکیل هاله (منفی).
• کاربرد اصلی: تست فعالیت پروتئولیتیک (کازئیناز) در شناسایی میکروارگانیسم‌ها، غربالگری سویه‌های تولیدکننده پروتئاز برای صنایع تخمیری و شوینده، و بررسی پتانسیل فساد میکروبی مواد غذایی پروتئینی.

نکات کاربردی و نگهداری

محیط Skim Milk Agar محصول ایبرسکو (IBRESco) به صورت پودر یکپارچه یا دو جزئی ارائه می‌شود. اگر به صورت یکپارچه است، پس از حل کردن در آب مقطر، باید با دمای پایین‌تر (مثلاً ۱۱۵ درجه سانتی‌گراد) و زمان کمتر اتوکلاو شود تا از کارامل شدن قندهای شیر و سفت شدن بیش از حد آن جلوگیری گردد. اگر به صورت پایه آگار و شیر جداگانه است، پایه آگار را اتوکلاو کرده، پس از سرد شدن به حدود ۴۵-۵۰ درجه، شیر استریل فیلترشده (معمولاً ۱۰٪) را اضافه کرده و هم بزنید. محیط نهایی باید یکنواخت و مات باشد. پلیت‌های آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و برای مدت کوتاه (۱-۲ هفته) نگهداری کرد، زیرا مواد شیر می‌توانند فاسد شوند. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق برسند و سطح آن‌ها خشک باشد. برای کشت، از یک اینوکولوم مناسب (یک کلونی یا مقدار کمی از کشت مایع) استفاده کنید. خوانش نتیجه باید با نگه داشتن پلیت در برابر نور انجام شود تا هاله شفاف به وضوح دیده شود. اندازه هاله شفاف می‌تواند نشان‌دهنده قدرت نسبی فعالیت پروتئولیتیک باشد. برخی میکروارگانیسم‌ها ممکن است ابتدا باعث رسوب کازئین (لخته شدن) شوند که با هاله شفاف متفاوت است. تست باید روی کشت خالص انجام شود، زیرا میکروارگانیسم‌های غیرپروتئولیتیک ممکن است در هاله ایجادشده توسط یک پروتئولیتیک رشد کنند و نتیجه را مخدوش نمایند. برای باکتری‌های هوازی، کشت سطحی کافی است، اما برای بی‌هوازی‌ها ممکن است نیاز به شرایط بی‌هوازی باشد.