محیط کشت بوشنل هاس آگار 2

محیط کشت آگار بوشنل هاس (Bushnell Haas Agar)

محیط کشت Bushnell Haas Agar یک محیط حداقل (Minimal Medium) است که فاقد هرگونه منبع کربن و نیتروژن آلی پیچیده (مانند پپتون، عصاره مخمر یا گوشت) می‌باشد. این محیط تنها حاوی نمک‌های معدنی ضروری (نیترات آمونیوم به عنوان منبع نیتروژن، فسفات‌ها، سولفات منیزیم، کلرید کلسیم و کلرید آهن) است. اصل پایه در استفاده از این محیط، اضافه کردن یک ترکیب آلی خاص (مانند یک هیدروکربن نفتی، روغن، حلال یا آلاینده) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی به محیط است. میکروارگانیسم‌هایی که دارای آنزیم‌های لازم برای متابولیزه کردن آن ترکیب باشند، قادر به رشد روی این محیط خواهند بود، در حالی که سایر میکروارگانیسم‌ها رشد نخواهند کرد.

کاربرد اصلی این محیط در تحقیقات زیست‌پالایی (Bioremediation)، میکروبیولوژی محیطی و صنعت نفت است. از آن برای جداسازی و شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده هیدروکربن‌ها از خاک، آب یا فاضلاب آلوده به نفت، ارزیابی پتانسیل تجزیه زیستی یک ترکیب خاص، و نیز برای نگهداری و کشت باکتری‌های تجزیه‌کننده استفاده می‌شود. رشد روی این محیط به صورت تشکیل کلونی‌های مجزا در اطراف یا روی ذرات ماده آلی اضافه‌شده (در صورتی که به صورت نامحلول باشد) قابل مشاهده است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، تعریف‌شده معدنی (Minimal Defined Medium) برای تست‌های تجزیه زیستی
• هدف کشت: جداسازی و ارزیابی میکروارگانیسم‌های قادر به استفاده از یک ترکیب آلی خاص (مانند هیدروکربن) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود و سپس اتوکلاو). منبع کربن انتخابی پس از استریل‌سازی اضافه می‌شود.
• ترکیبات کلیدی پایه (بدون منبع کربن): نیترات آمونیوم، دی‌پتاسیم فسفات، مونوپتاسیم فسفات، سولفات منیزیم، کلرید کلسیم، کلرید آهن، آگار
• منبع کربن اضافه‌شونده: ترکیب مورد آزمایش (مانند نفت خام، گازوئیل، تولوئن، فنول، روغن گیاهی) که باید به صورت استریل و معمولاً در غلظت مشخص (مثلاً ۱٪ حجمی/حجمی) به محیط اضافه شود.
• شرایط کشت: پس از افزودن منبع کربن، محیط در پلیت ریخته می‌شود. کشت می‌تواند به صورت سطحی یا Spread Plate انجام شود.
• شرایط انکوباسیون: معمولاً ۲۵ تا ۳۰ درجه سانتی‌گراد (دمای محیط) به مدت ۳ تا ۷ روز یا بیشتر (بسته به سرعت رشد میکروارگانیسم و قابلیت تجزیه ترکیب).
• خوانش نتیجه: مثبت (تجزیه‌کننده): تشکیل کلونی‌های قابل مشاهده روی پلیت. منفی (غیرتجزیه‌کننده): عدم رشد. گاهی تشکیل هاله شفاف در اطراف کلونی در صورت تولید سورفکتانت یا حل شدن ترکیب دیده می‌شود.
• کنترل کیفیت: رشد خوب با یک سویه شناخته شده تجزیه‌کننده (مانند Pseudomonas putida برای تولوئن) در حضور منبع کربن مناسب. عدم رشد در پلیت فاقد منبع کربن (کنترل منفی).
• کاربرد اصلی: مطالعات زیست‌پالایی، غربالگری باکتری‌های تجزیه‌کننده آلاینده‌ها، و ارزیابی پتانسیل تجزیه زیستی در نمونه‌های محیطی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه Bushnell Haas Agar باید در جای خشک نگهداری شود. از آب مقطر با کیفیت بالا برای حل کردن نمک‌ها استفاده شود. پس از اتوکلاو محیط پایه و سرد شدن آن تا حدود ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد، منبع کربن انتخابی باید اضافه شود. اگر منبع کربن فرار است (مانند تولوئن)، می‌توان آن را پس از ریختن پلیت‌ها در فضای دربسته به محیط اضافه کرد یا از روش‌های خاص استفاده نمود. برای منابع کربن نامحلول در آب (مانند نفت خام)، مخلوط کردن کامل مهم است. پلیت‌های آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد برای مدت کوتاه نگهداری کرد. قبل از کشت، سطح پلیت باید خشک باشد. تلقیح می‌تواند با سوسپانسیون میکروبی یا مستقیم با نمونه محیطی (خاک، آب) انجام شود. انکوباسیون اغلب طولانی است و پلیت‌ها باید در ظروف دربسته (برای جلوگیری از تبخیر ترکیبات فرار) نگهداری شوند. تفسیر رشد ممکن است به دلیل مات بودن محیط (در صورت اضافه شدن نفت) دشوار باشد، بنابراین مشاهده با نور مناسب ضروری است. برای مطالعات کمی، ممکن است از روش Most Probable Number (MPN) در محیط مایع Bushnell Haas Broth استفاده شود. تمام کارها با ترکیبات آلی بالقوه سمی باید در هود بخار انجام گیرد.