محیط کشت بوشنل هاس براث 1

محیط کشت براث بوشنل هاس (Bushnell Haas Broth)

محیط کشت Bushnell Haas Broth فرم مایع محیط جامد Bushnell Haas Agar است. این محیط یک محیط حداقل (Minimal Medium) تعریف‌شده است که فاقد هرگونه منبع کربن آلی است و تنها حاوی نمک‌های معدنی ضروری می‌باشد: نیترات آمونیوم به عنوان منبع نیتروژن، فسفات‌ها به عنوان بافر و منبع فسفر، سولفات منیزیم، کلرید کلسیم، و کلرید آهن. اصل کار بر این پایه است که یک ترکیب آلی مشخص (مانند یک هیدروکربن نفتی، حلال یا آلاینده) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی به محیط اضافه می‌شود. میکروارگانیسم‌هایی که آنزیم‌های مورد نیاز برای متابولیزه کردن آن سوبسترا را داشته باشند، قادر به رشد در این محیط خواهند بود که معمولاً از طریق افزایش کدورت، تغییر رنگ یا کاهش غلظت سوبسترا اندازه‌گیری می‌شود.

کاربرد اصلی این محیط در تحقیقات زیست‌پالایی (Bioremediation) و میکروبیولوژی محیطی است. از آن برای غربالگری اولیه سویه‌های تجزیه‌کننده، مطالعات سینتیک تجزیه (با اندازه‌گیری نرخ کاهش سوبسترا یا تولید دی‌اکسیدکربن)، تخمین شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده با روش MPN (Most Probable Number)، و همچنین برای تولید انبوه (فرم‌شدن) این باکتری‌ها برای آزمایش‌های بعدی استفاده می‌شود. این محیط ابزار استانداردی برای ارزیابی پتانسیل تجزیه زیستی خاک یا آب آلوده و نیز برای تست‌های سمیت زیستی است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث)، تعریف‌شده معدنی (Minimal Defined Medium) برای تست‌های تجزیه زیستی
• هدف کشت: ارزیابی توانایی میکروارگانیسم‌ها در استفاده و تجزیه یک ترکیب آلی خاص به عنوان تنها منبع کربن و انرژی در فاز مایع
• حالت فیزیکی: پودر پایه (حل شونده در آب مقطر و سپس اتوکلاو). منبع کربن انتخابی پس از استریل‌سازی اضافه می‌شود.
• ترکیبات کلیدی پایه (بدون منبع کربن): نیترات آمونیوم، دی‌پتاسیم فسفات، مونوپتاسیم فسفات، سولفات منیزیم، کلرید کلسیم، کلرید آهن
• منبع کربن اضافه‌شونده: ترکیب مورد آزمایش (مانند نفت خام، گازوئیل، فنول، بنزن، روغن) که باید به صورت استریل و در غلظت مشخص (معمولاً ۰.۱-۱٪) به محیط اضافه شود.
• شرایط کشت: محیط در لوله‌ها، ویال‌ها یا فلاسک‌های شیشه‌ای درب‌دار (اغلب با فضای هوای محدود برای مطالعات هوازی) ریخته می‌شود. کشت با سوسپانسیون میکروبی یا نمونه محیطی تلقیح می‌گردد.
• شرایط انکوباسیون: معمولاً ۲۵ تا ۳۰ درجه سانتی‌گراد (دمای محیط) به مدت چند روز تا چند هفته، اغلب با تکان‌دهی (Shaking) برای بهبود اختلاط و تبادل گاز در کشت‌های هوازی.
• خوانش نتیجه: مثبت (تجزیه‌کننده): افزایش کدورت (رشد میکروبی)، کاهش غلظت سوبسترا (با روش‌های شیمیایی مانند GC، HPLC)، یا تولید دی‌اکسیدکربن (با روش respirometry). منفی (غیرتجزیه‌کننده): عدم تغییر در کدورت یا غلظت سوبسترا.
• کنترل کیفیت: رشد و کاهش سوبسترا توسط یک سویه شناخته شده تجزیه‌کننده (مثلاً Pseudomonas putida در حضور تولوئن). عدم رشد در لوله‌های کنترل بدون منبع کربن یا با یک منبع کربن غیرقابل تجزیه.
• کاربرد اصلی: مطالعات زیست‌پالایی، سنجش تجزیه زیستی، تخمین MPN باکتری‌های تجزیه‌کننده و تحقیقات متابولیکی روی میکروارگانیسم‌های تجزیه‌کننده آلاینده‌ها.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه Bushnell Haas Broth باید در جای خشک نگهداری شود. از آب مقطر با خلوص بالا استفاده کنید. پس از اتوکلاو محیط پایه و سرد شدن آن، منبع کربن انتخابی باید تحت شرایط استریل (یا با فیلتراسیون برای ترکیبات محلول) اضافه شود. برای ترکیبات فرار (مانند حلال‌ها)، باید از ویال‌های درب‌سته با مهر و موم مناسب یا سیستم‌های ویژه استفاده کرد تا از تبخیر جلوگیری شود. حجم محیط در فلاسک نباید بیش از ۲۰٪ حجم کل باشد تا اکسیژن‌رسانی کافی فراهم گردد (برای کشت هوازی). تلقیح باید با سوسپانسیونی از میکروارگانیسم‌های سازگار شده (acclimated) یا نمونه محیطی غلیظ انجام گیرد. برای اندازه‌گیری کمی رشد، می‌توان از سنجش کدورت (جذب نوری در ۶۰۰ نانومتر) استفاده کرد، اما حضور قطرات نامحلول منبع کربن (ماننذ نفت) ممکن است تداخل ایجاد کند. روش‌های جایگزین شامل اندازه‌گیری تولید CO2، کاهش COD (اکسیژن مورد نیاز شیمیایی) یا آنالیز مستقیم سوبسترا است. کشت‌های منفی باید برای مدت طولانی (تا ۴-۶ هفته) انکوبه شوند تا تجزیه‌کننده‌های کندرشد نیز شناسایی شوند. تمام کارها با ترکیبات آلی سمی یا فرار باید در هود بخار شیمیایی انجام شود. برای تست MPN، یک سری رقت از نمونه محیطی در محیط تلقیح شده و حضور/عدم رشد در هر لوله پس از انکوباسیون ثبت می‌شود.