محیط کشت دیفرنشیال رینفورسد کلوستریدیال آگار

محیط کشت افتراقی کلستریدیا آگار غنی‌شده (Differential Reinforced Clostridial Agar)

محیط کشت Differential Reinforced Clostridial Agar (DRCA) یک محیط چندمنظوره است که سه ویژگی کلیدی را ترکیب می‌کند: غنی‌سازی بالا، انتخاب‌گری و افتراق. پایه آن محیط Reinforced Clostridial Agar (RCA) است که حاوی منابع مغذی بسیار غنی (پپتون، عصاره گوشت، عصاره مخمر، نشاسته، سیستئین) برای حمایت از رشد سخت‌پرورترین کلستریدیاها و دیگر بی‌هوازی‌ها می‌باشد. برای ایجاد خاصیت افتراقی، سدیم سولفیت و یک نمک آهن (مانند سیترات فرو آمونیوم) به آن افزوده می‌شود. کلستریدیاهای احیاکننده سولفیت (نظیر C. perfringens)، سولفیت را به سولفید احیا کرده که با آهن واکنش داده و سولفید آهن سیاه نامحلول را تشکیل می‌دهد. در نتیجه کلنی‌های این باکتری‌ها به رنگ سیاه ظاهر می‌شوند. برای افزایش انتخاب‌گری، اغلب آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند سیکلوسرین یا د-سیکلوسرین برای مهار فلور همراه اضافه می‌شود.

کاربرد اصلی این محیط در میکروبیولوژی مواد غذایی برای شمارش و تأیید Clostridium perfringens (مطابق با برخی استانداردها) و در آزمایشگاه‌های تشخیصی برای جداسازی کلستریدیاهای پاتوژن از نمونه‌های زخم، مدفوع و بافت است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار) بسیار غنی‌شده، انتخابی و افتراقی برای کلستریدیاهای احیاکننده سولفیت تحت شرایط بی‌هوازی
• هدف کشت: جداسازی، شمارش و افتراق اولیه کلستریدیاهای احیاکننده سولفیت (عمدتاً Clostridium perfringens) بر اساس تشکیل کلنی سیاه
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده تا حل شود، سپس اتوکلاو می‌شود. آنتی‌بیوتیک انتخابی پس از اتوکلاو اضافه می‌گردد).
• ترکیبات کلیدی پایه (غنی‌ساز): پپتون، عصاره گوشت، عصاره مخمر، نشاسته، گلوکز (یا دکستروز)، سیستئین هیدروکلراید (کاهنده)، آگار.
• ترکیبات کلیدی افتراقی: سدیم سولفیت (سوبسترای احیا)، سیترات فرو آمونیوم یا سولفات فرو (منبع آهن برای تشکیل رنگدانه سیاه).
• ترکیبات کلیدی انتخابی (اختیاری اما رایج): د-سیکلوسرین (D-Cycloserine) (برای مهار انتخابی باکتری‌های غیرهدف، به ویژه در روش‌های غذایی).
• شرایط کشت: معمولاً به روش Pour Plate (محیط مذاب با نمونه مخلوط می‌شود) یا Spread Plate بر روی سطح محیط جامد شده. پلیت‌ها بلافاصله باید در شرایط بی‌هوازی مطلق (با استفاده از ژار بی‌هوازی، پک‌های ایجادکننده گاز یا انکوباتور بی‌هوازی) قرار گیرند.
• شرایط انکوباسیون: دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد تحت اتمسفر بی‌هوازی به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت.
• خوانش نتیجه: مثبت (احیاکننده سولفیت): تشکیل کلنی‌های سیاه (گاهی با هاله تیره در اطراف). منفی (غیر احیاکننده): کلنی‌های بی‌رنگ، خاکستری یا به رنگ محیط. شمارش بر اساس کلنی‌های سیاه انجام می‌شود.
• کنترل کیفیت: رشد خوب و تشکیل کلنی‌های سیاه مشخص با سویه Clostridium perfringens ATCC 13124. عدم تشکیل کلنی سیاه با سویه‌های کلستریدیایی که سولفیت را احیا نمی‌کنند (در صورت امکان). مهار رشد برخی آلودگی‌های رایج با آنتی‌بیوتیک انتخابی.
• کاربرد اصلی: روش انتخابی برای شمارش Clostridium perfringens در مواد غذایی (به عنوان بخشی از روش‌های تأییدی)، و ابزار تشخیصی برای جداسازی کلستریدیاهای پاتوژن در آزمایشگاه‌های بالینی و دامپزشکی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Differential Reinforced Clostridial Agar (DRCA) باید در جای خشک و خنک و دور از نور (به دلیل حساسیت سولفیت) نگهداری شود. پس از اتوکلاو، محیط را تا حدود ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد سرد کرده و در صورت نیاز، آنتی‌بیوتیک انتخابی استریل را اضافه کنید. برای روش Pour Plate، نمونه را مستقیماً با محیط مذاب مخلوط کرده و در پلیت بریزید. رعایت دقیق شرایط بی‌هوازی از لحظه کشت تا پایان انکوباسیون برای جلوگیری از مرگ باکتری‌های بی‌هوازی اجباری و اکسیداسیون سولفیت حیاتی است. پلیت‌های آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد برای مدت کوتاه و ترجیحاً در بسته‌بندی بی‌هوازی نگهداری کرد. کلنی‌های سیاه لزوماً متعلق به C. perfringens نیستند؛ گونه‌های دیگری مانند C. baratii یا C. absonum نیز ممکن است مثبت باشند. بنابراین تأیید با تست‌های بیوشیمیایی تکمیلی (مانند تست عدم حرکت، تخمیر لاکتوز، تولید لیسیتیناز و ناقلبازی شیر) ضروری است. محصول با کیفیت ایبرسکو (IBRESco)، با فرمولاسیون بهینه، رشد عالی و واکنش افتراقی واضحی را برای این باکتری‌های مهم بی‌هوازی فراهم می‌کند.