محیط کشت دیفرنشیال کلوستریدیال آگار

محیط کشت افتراقی کلستریدیا آگار طبق وینک (Differential Clostridial Agar DCA acc. to Weenk)

محیط کشت DCA according to Weenk یک محیط پیچیده است که چندین مکانیسم انتخابی و افتراقی را ترکیب می‌کند. پایه غنی‌شده (حاوی پپتون، عصاره مخمر و نشاسته) رشد کلستریدیا و باکتری‌های بی‌هوازی دیگر را پشتیبانی می‌کند. انتخاب‌گری از طریق سیکلوسرین (Cycloserine) به عنوان یک آنتی‌بیوتیک انتخابی برای مهار فلور گرم منفی و بسیاری از گرم مثبت‌ها (به جز کلستریدیوم‌های هدف) و نیز شرایط بی‌هوازی اجباری حاصل می‌شود. جزء افتراقی کلیدی، حضور سولفیت سدیم و سیترات فرو آمونیوم است. کلستریدیوم‌های احیاکننده سولفیت (مانند C. perfringens)، سولفیت را به سولفید احیا می‌کنند که با آهن واکنش داده و سولفید آهن سیاه نامحلول را تشکیل می‌دهد. در نتیجه، کلنی‌های این باکتری‌ها به رنگ سیاه درمی‌آیند. گونه‌های غیر احیاکننده سولفیت، کلنی‌های بی‌رنگ یا خاکستری ایجاد می‌کنند.

کاربرد اصلی این محیط در کنترل کیفیت میکروبیولوژی مواد غذایی (به ویژه گوشت، مرغ و غذاهای آماده) برای تشخیص و شمارش Clostridium perfringens به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی یا شرایط فرآوری نامناسب، و نیز در آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی و دامپزشکی برای بررسی نمونه‌های مدفوع است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار) انتخابی و افتراقی برای کلستریدیاهای احیاکننده سولفیت تحت شرایط بی‌هوازی
• هدف کشت: جداسازی، شمارش و افتراق کلستریدیاهای احیاکننده سولفیت (عمدتاً Clostridium perfringens) بر اساس تشکیل کلنی سیاه
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده تا حل شود، سپس اتوکلاو می‌شود. سیکلوسرین معمولاً پس از اتوکلاو و سرد شدن به صورت محلول استریل اضافه می‌گردد).
• ترکیبات کلیدی پایه و افتراقی: پپتون، عصاره مخمر، نشاسته (منبع انرژی)، سولفیت سدیم (سوبسترای احیا)، سیترات فرو آمونیوم (منبع آهن برای تشکیل سولفید سیاه)، آگار.
• ترکیبات کلیدی انتخابی: سیکلوسرین (مهارکنندۀ طیف وسیعی از باکتری‌های غیرهدف).
• شرایط کشت: محیط در پلیت ریخته می‌شود. نمونه (معمولاً رقیق‌شده) به روش Spread Plate یا Pour Plate کشت داده می‌شود. پلیت‌ها باید بلافاصله در شرایط بی‌هوازی کامل (با استفاده از ژار بی‌هوازی، پَک یا سیستم تزریق گاز) قرار گیرند.
• شرایط انکوباسیون: دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد تحت اتمسفر بی‌هوازی به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت.
• خوانش نتیجه: کلنی‌های مثبت (احیاکننده سولفیت): کلنی‌های سیاه (گاهی با هاله سیاه در اطراف). این کلنی‌ها معمولاً مربوط به C. perfringens یا گونه‌های مرتبط هستند. کلنی‌های منفی (غیر احیاکننده): کلنی‌های بی‌رنگ، خاکستری یا زرد. شمارش کلنی‌های سیاه انجام می‌شود.
• کنترل کیفیت: رشد خوب و تشکیل کلنی‌های سیاه مشخص با سویه Clostridium perfringens ATCC 13124. عدم رشد یا کلنی‌های بی‌رنگ با سویه غیر احیاکننده (در صورت امکان). مهار رشد Escherichia coli با سیکلوسرین.
• کاربرد اصلی: روش استاندارد برای شمارش Clostridium perfringens در مواد غذایی (مانند ISO 7937) و کمک به تشخیص در نمونه‌های بالینی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Differential Clostridial Agar (DCA) acc. to Weenk باید در جای خشک و خنک و دور از نور (به دلیل حساسیت سولفیت) نگهداری شود. پس از اتوکلاو محیط پایه، آن را تا حدود ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد سرد کرده و سپس محلول استریل فیلترشدۀ سیکلوسرین را اضافه کنید. مخلوط کرده و بلافاصله در پلیت بریزید. تهیه و نگهداری شرایط بی‌هوازی مطلق طی کشت و انکوباسیون برای موفقیت این روش حیاتی است. پلیت‌های آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد، ترجیحاً در بسته‌بندی بی‌هوازی یا تحت گاز نیتروژن، برای مدت کوتاهی نگهداری کرد. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق برسند و در معرض هوا برای مدت طولانی نباشند. تفسیر نتایج: همه کلنی‌های سیاه لزوماً C. perfringens نیستند؛ تأیید با تست‌های تکمیلی (مانند تست حرکت، تخمیر لاکتوز، احیای نیترات و تولید لیسیتیناز روی صفحه محور) ضروری است. محصول با کیفیت ایبرسکو (IBRESco)، با فرمولاسیون دقیق مطابق با روش وینک، نتایج قابل تکرار و قابل اعتمادی برای نظارت بر این پاتوژن مهم غذایی و محیطی فراهم می‌کند.