محیط کشت رینفورسد کلوستریدیال مدیوم 2

محیط کشت کلستریدیوم تقویت شده (Reinforced Clostridial Medium)

محیط کشت Reinforced Clostridial Medium (RCM) یک محیط چندمنظوره غنی برای بی‌هوازی‌ها است که فرمولاسیون آن ترکیبی از مواد مغذی پیچیده (مانند پپتون، عصاره مخمر، عصاره گوشت)، یک منبع کربوهیدرات (گلوکز)، و عوامل کاهنده قوی (مانند سیستئین هیدروکلراید و گاهی تیوگلیکولات سدیم) می‌باشد. حضور عوامل کاهنده، پتانسیل اکسیداسیون-احیا (Eh) محیط را به شدت پایین می‌آورد و شرایط بی‌هوازی مطلوبی را حتی قبل از قرارگیری در جو بی‌هوازی (مثل ژار) ایجاد می‌کند. این ویژگی برای رشد باکتری‌های بی‌هوازی مطلق مانند کلستریدیوم‌ها که به اکسیژن حساس هستند، حیاتی است. محیط RCM هم به صورت براث و هم به صورت آگار (با افزودن آگار) قابل تهیه است. فرم براث آن اغلب به عنوان محیط پایه برای تست‌های بیوشیمیایی بی‌هوازی‌ها یا به عنوان محیط نگهداری استفاده می‌شود، در حالی که فرم آگار برای جداسازی کلونی‌ها کاربرد دارد.

کاربردهای اصلی RCM در میکروبیولوژی غذایی (برای شمارش و جداسازی کلستریدیوم‌ها، مانند C. perfringens در مواد غذایی)، میکروبیولوژی بالینی (کشت بی‌هوازی‌ها از نمونه‌های زخم، خون و …)، و تحقیقات (مطالعه میکروبیوم بی‌هوازی و فرآیندهای تخمیر) می‌باشد. این محیط به عنوان یک محیط پایه خوب برای بسیاری از بی‌هوازی‌ها شناخته می‌شود، اگرچه برای برخی گونه‌های بسیار سخت‌رض可能需要 مکمل‌های اضافی باشد.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث) یا جامد (آگار)، غنی (Rich)، نیمه‌انتخابی (به دلیل شرایط کاهش‌یافته)، برای بی‌هوازی‌ها.
• هدف کشت: کشت، غنی‌سازی و جداسازی باکتری‌های بی‌هوازی مطلق، به ویژه اعضای جنس کلستریدیوم (Clostridium) و سایر بی‌هوازی‌های گرم مثبت و گرم منفی.
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود، سپس به روش معمول اتوکلاو می‌شود). عوامل کاهنده معمولاً در حین اتوکلاو پایدار هستند.
• ترکیبات کلیدی تغذیه‌ای: پپتون، عصاره مخمر، عصاره گوشت، گلوکز (منبع کربوهیدرات قابل تخمیر)، استات سدیم (بافر).
• ترکیبات کلیدی کاهنده (ایجاد شرایط بی‌هوازی): سیستئین هیدروکلراید (عامل کاهنده اصلی)، اغلب همراه با تیوگلیکولات سدیم (در برخی فرمولاسیون‌ها).
• مکانیسم عمل: ایجاد یک محیط کاهنده با Eh پایین برای خنثی‌سازی سمیت اکسیژن و تشویق رشد بی‌هوازی‌ها. مواد مغذی غنی نیز رشد طیف وسیعی از بی‌هوازی‌ها را پشتیبانی می‌کند.
• شرایط کشت: کشت عمقی (در براث) یا سطحی (در آگار). محیط براث باید بلافاصله قبل از استفاده به خوبی مخلوط شود تا اکسیژن حل‌شده خارج گردد. استفاده از لوله‌های عمیق یا ظروف مخصوص بی هوازی توصیه می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: در شرایط بی‌هوازی مطلق (استفاده از ژار، کیسه بی هوازی یا چمبر بی هوازی با گاز مخلوط حاوی ۸۰٪ نیتروژن، ۱۰٪ دی‌اکسید کربن، ۱۰٪ هیدروژن) به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت (گاهی تا ۵ روز برای گونه‌های کندرشد) در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد.
• خوانش نتیجه: در براث: کدورت، تولید گاز (شکستن آگار در صورت موجود بودن)، بوی مشخص (مثلاً بوی کره‌ای در C. perfringens). در آگار: تشکیل کلونی‌های مختلف (معمولاً با مراکز سفت و حاشیه پراکنده برای برخی کلستریدیوم‌ها). کلونی‌ها ممکن است رنگ‌های متفاوت داشته باشند.
• کنترل کیفیت: رشد خوب با سویه Clostridium perfringens ATCC 13124 (کنترل مثبت). عدم رشد با یک سویه هوازی اجباری مانند Pseudomonas aeruginosa (کنترل منفی برای شرایط بی هوازی).
• کاربرد اصلی: کشت پایه و جداسازی بی‌هوازی‌ها در آزمایشگاه تشخیصی، شمارش کلستریدیوم‌ها در مواد غذایی و نمونه‌های محیطی، محیط نگهداری برای سویه‌های بی‌هوازی، و به عنوان محیط پایه برای تهیه محیط‌های بیوشیمیایی بی هوازی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Reinforced Clostridial Medium محصول ایبرسکو (IBRESco) باید در جای خشک و خنک نگهداری شود. برای تهیه محیط، پودر را در آب مقطر حل کرده و با حرارت ملایم به جوش آورید تا کاملاً حل شود. می‌توان آن را اتوکلاو کرد (۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه). برای حفظ شرایط کاهنده، محیط آماده شده (مخصوصاً براث) باید بلافاصله قبل از استفاده به خوبی تکان داده یا همزده شود تا اکسیژن جذب شده در سطح آزاد گردد. محیط براث RCM را می‌توان در لوله‌های بلند (عمقی) ریخت تا ستون مایع بلندتری ایجاد کند که شرایط بی‌هوازی را در عمق بهتر حفظ می‌کند. برای جداسازی، استفاده از فرم آگار و کشت در شرایط بی‌هوازی استاندارد (ژار) ضروری است. از آنجایی که گلوکز در محیط وجود دارد، تولید گاز و اسید از تخمیر آن توسط بسیاری از بی‌هوازی‌ها رخ می‌دهد که یک شاخص مفید است. پلیت‌ها یا لوله‌های آماده را می‌توان به مدت محدود در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و در بسته‌بندی محکم (برای جلوگیری از ورود اکسیژن) نگهداری کرد، اما استفاده تازه بهتر است. برای نمونه‌های غذایی، اغلب یک مرحله شوک حرارتی (مثلاً ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۰ دقیقه) برای از بین بردن سلول‌های رویشی و انتخاب اسپورهای کلستریدیوم قبل از کشت در RCM انجام می‌شود. تمام مراحل کشت و جابجایی باید با هدف به حداقل رساندن مواجهه نمونه با اکسیژن انجام شود.