محیط کشت نیترات براث

محیط کشت نیترات براث (Nitrate Broth)

محیط کشت Nitrate Broth یک محیط پایه حاوی نیترات پتاسیم (KNO₃) به عنوان سوبسترای اصلی است. این محیط فاقد هرگونه عامل کاهنده است تا اجازه دهد تنها باکتری‌های مورد آزمایش، در صورت داشتن آنزیم‌های لازم، فرآیند احیای نیترات را انجام دهند. محیط معمولاً حاوی پپتون و عصاره گوشت به عنوان منابع تغذیه‌ای است. پس از دوره انکوباسیون، برای تشخیص تشکیل نیتریت، معرف‌های سولفانیلیک اسید (در محیط اسیدی) و آلفا-نفتیل آمین به محیط اضافه می‌شوند. اگر باکتری نیترات را به نیتریت احیا کرده باشد، این معرف‌ها با نیتریت واکنش داده و یک ترکیب دیازو تشکیل می‌دهند که به رنگ قرمز یا صورتی درمی‌آید. اگر پس از افزودن معرف‌ها هیچ رنگی ایجاد نشود، دو احتمال وجود دارد: یا نیترات اصلاً احیا نشده (نتیجه منفی)، یا احیا فراتر از مرحله نیتریت رفته و به ترکیباتی مانند آمونیاک، نیتروژن یا اکسید نیترو تبدیل شده است. برای افتراق این دو حالت، مقداری پودر روی (Zn) به محیط اضافه می‌کنند. روی به عنوان یک کاهنده شیمیایی، هر نیترات باقی‌مانده در محیط را به نیتریت احیا می‌کند. اگر پس از افزودن روی رنگ قرمز ایجاد شود، نشان‌دهنده این است که نیترات هنوز در محیط وجود داشته (یعنی باکتری آن را احیا نکرده) و نتیجه تست منفی است. اگر پس از افزودن روی نیز رنگی ایجاد نشود، به این معنی است که نیترات به طور کامل توسط باکتری احیا شده و به فرآورده‌هایی غیر از نیتریت تبدیل شده است که نتیجه آن مثبت محسوب می‌شود.

کاربرد اصلی این محیط در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی و تشخیصی برای شناسایی و تمایز باکتری‌ها، به ویژه اعضای خانواده انتروباکتریاسه (مانند تشخیص E. coli از Klebsiella یا Enterobacter) و نیز برای شناسایی برخی باکتری‌های غیرانتروباکتریاسه مانند Pseudomonas و Neisseria است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث)، تشخیصی برای تست بیوشیمیایی
• هدف کشت: انجام تست احیای نیترات برای شناسایی باکتری‌ها
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی پپتون، نیترات پتاسیم و عصاره گوشت) که پس از حل کردن در آب مقطر، در لوله‌ها توزیع و اتوکلاو می‌شود.
• ترکیبات کلیدی: پپتون، عصاره گوشت، نیترات پتاسیم (KNO₃)
• اصول آزمون: ارزیابی توانایی باکتری در احیای نیترات به نیتریت یا فرآورده‌های گازی با استفاده از معرف‌های شیمیایی.
• شرایط کشت: لوله محیط با یک کلنی یا سوسپانسیون خالص از باکتری تلقیح می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت (گاهی تا ۵ روز برای برخی باکتری‌های کند).
• خوانش نتیجه: مرحله اول (پس از انکوباسیون): افزودن معرف‌های A (سولفانیلیک اسید) و B (آلفا-نفتیل آمین). نیتریت مثبت: ایجاد رنگ قرمز/صورتی فوری (نتیجه مثبت). عدم رنگ‌گیری: ادامه به مرحله دوم. مرحله دوم (تست تأییدی): افزودن مقدار کمی پودر روی. نیتریت مثبت پس از روی: ایجاد رنگ قرمز (نتیجه منفی، نیترات احیا نشده). نیتریت منفی حتی پس از روی: عدم رنگ‌گیری (نتیجه مثبت، احیای کامل نیترات به فرآورده‌های دیگر).
• کنترل کیفیت: سویه Escherichia coli ATCC 25922: نتیجه مثبت (تشکیل رنگ قرمز در مرحله اول). سویه Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: نتیجه مثبت (عدم رنگ‌گیری در مرحله اول و دوم، احیا به گاز). سویه Acetobacter aceti ATCC 15973: نتیجه منفی (رنگ قرمز فقط پس از افزودن روی).
• کاربرد اصلی: تست استاندارد برای شناسایی و افتراق باکتری‌های گرم منفی و برخی گرم مثبت بر اساس توانایی احیای نیترات.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر محیط Nitrate Broth ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و خنک نگهداری کنید. پس از اتوکلاو، محیط را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد نگهداری نمود. قبل از تلقیح، لوله‌ها باید به دمای اتاق برسند. حتماً از معرف‌های تازه تهیه شده استفاده کنید (معرف A و B). معرف‌ها را می‌توان روی کاغذ صافی استریل نیز آغشته و به صورت دیسک‌های آماده استفاده کرد. مقدار معرف اضافه شده باید کافی باشد (معمولاً ۳-۵ قطره از هر کدام). پس از افزودن معرف‌ها، لوله را به آرامی تکان دهید. تفسیر رنگ باید بلافاصله انجام شود، زیرا رنگ ممکن است با گذشت زمان محو شود. هنگام افزودن پودر روی، مقدار بسیار کمی (نوک اسپاتول) کافی است. اضافه کردن روی زیاد می‌تواند نتیجه را مخدوش کند. کار با پودر روی باید با احتیاط انجام شود. برای باکتری‌هایی که به کندی رشد می‌کنند یا آنزیم‌های احیای نیترات ضعیفی دارند، ممکن است نیاز به انکوباسیون طولانی‌تر (تا ۵ روز) باشد. اگر محیط حاوی حباب‌های گاز باشد، ممکن است نشانه احیای نیترات به گازهای نیتروژن یا اکسید نیترو باشد. تست احیای نیترات بخشی از مجموعه تست‌های استاندارد برای شناسایی انتروباکتریاسه‌ها است.