محیط کشت BCYE آگار بیس

محیط کشت پایه آگار بی‌سی‌وای‌ای (BCYE Agar Base)

محیط کشت Buffered Charcoal Yeast Extract Agar (BCYE) محیط استاندارد طلایی برای کشت لژیونلا است. این محیط ترکیبی منحصر به فرد از مواد مغذی ضروری و عوامل محافظت‌کننده را فراهم می‌کند: عصاره مخمر منبع اصلی اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و مواد معدنی است. ذغال فعال (Charcoal) به جذب مواد سمی متابولیکی که ممکن است در طی انکوباسیون ایجاد شوند، کمک می‌کند. یک سیستم بافر (ACES Buffer) pH محیط را در محدوده بهینه (حدود ۶.۹) ثابت نگه می‌دارد. افزودن آلفا-کتوگلوتارات یک منبع کربن ضروری و یک پیش‌ساز اسیدهای آمینه برای لژیونلا فراهم می‌کند. سیستئین نیز یک اسید آمینه ضروری برای این باکتری است که به محیط اضافه می‌شود.

برای جداسازی انتخابی لژیونلا از نمونه‌های دارای فلور میکروبی مختلط (مانند نمونه‌های آب یا خلط)، به این محیط پایه، آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند سفاماندول، پلی‌میکسین B و آنیزومایسین اضافه می‌شود که محیط نهایی BCYE Agar with Antibiotics (یا GVPC) را تشکیل می‌دهد. لژیونلا روی این محیط پس از ۳ تا ۵ روز انکوباسیون، کلونی‌های سفید-آبی، خاکستری یا سبز با مرکز رنگی و سطح براق شبیه شیشه ساب‌زده ایجاد می‌کند. این محیط به طور گسترده در آزمایشگاه‌های تشخیصی بالینی (برای کشت نمونه‌های تنفسی) و در پایش محیطی سیستم‌های آبی (برج‌های خنک‌کننده، آب‌های گرم‌کن) استفاده می‌شود.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، اختصاصی/غنی‌کننده (پایه برای تهیه محیط‌های انتخابی)
• هدف کشت: جداسازی و رشد باکتری‌های جنس Legionella
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود، سپس اتوکلاو. پس از سرد شدن، سیستئین و آلفا-کتوگلوتارات استریل اضافه می‌شود).
• ترکیبات کلیدی پایه: عصاره مخمر، ذغال فعال (Charcoal)، بافر ACES، آگار، نمک‌های معدنی
• مکمل‌های ضروری افزودنی (پس از اتوکلاو): L-سیستئین (محلول فیلتر-استریل)، فروم پیروفسفات سدیم، آلفا-کتوگلوتارات پتاسیم. برای محیط انتخابی: آنتی‌بیوتیک‌ها (GVPC یا مشابه).
• شرایط کشت: محیط در پلیت‌های عمیق ریخته می‌شود (به دلیل نیاز به رطوبت بالا). نمونه مستقیماً روی سطح کشت داده می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد، در اتمسفر مرطوب (۲.۵-۵٪ CO2 ترجیح داده می‌شود) به مدت حداقل ۵ تا ۷ روز، با بازرسی روزانه.
• خوانش نتیجه: کلونی‌های مشکوک لژیونلا: پس از ۳-۵ روز ظاهر می‌شوند. رنگ‌های متنوع (سفید، آبی، سبز، ارغوانی، صورتی). اغلب دارای مرکز رنگی، لبه‌ای براق و سطح “شیشه‌ای” یا “ساب‌خورده”. کلونی‌های قدیمی‌تر ممکن است رنگ خود را از دست بدهند.
• کنترل کیفیت: رشد خوب با Legionella pneumophila (ATCC 33152). عدم رشد یا رشد ضعیف با Escherichia coli (ATCC 25922).
• کاربرد اصلی: تشخیص بیماری لژیونر و پایش محیطی باکتری‌های لژیونلا در منابع آبی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه BCYE Agar Base به دلیل حساسیت ترکیبات، باید در جای خشک و خنک و دور از نور نگهداری شود. از آب مقطر با کیفیت بالا و فاقد مواد بازدارنده (ترجیحاً آب مقطر تازه) استفاده شود. پس از حل کردن پودر در آب و اتوکلاو، محیط باید به سرعت تا ۵۰-۵۵ درجه سانتی‌گراد خنک شود. سپس مکمل‌های فیلتر-استریل (سیستئین، آلفا-کتوگلوتارات و فروم) به دقت اضافه و مخلوط شوند. از گرم کردن مجدد محیط پس از افزودن این مکمل‌های حساس به حرارت خودداری کنید. پلیت‌ها را بلافاصله پس از ریختن در کیسه‌های پلاستیکی بسته‌بندی کرده و در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و دور از نور نگهداری نمایید. عمر مفید پلیت‌های آماده معمولاً ۲ تا ۴ هفته است، به شرطی که رطوبت حفظ شود. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق برسند و سطح آنها خشک نباشد. برای کشت نمونه‌های بالینی، سواب یا مواد تنفسی مستقیماً کشت داده می‌شوند. برای نمونه‌های آب، معمولاً از روش تغلیظ و اسید شوک (Acid treatment) قبل از کشت استفاده می‌گردد. بازرسی روزانه پلیت‌ها با نور مناسب و گاهی با لوپ ضروری است. کلونی‌های مشکوک باید برای تأیید با تست‌های سرولوژیکی (آگلوتیناسیون با آنتی‌سرم اختصاصی) یا روش‌های مولکولی (PCR) بررسی شوند. کار با کشت لژیونلا باید با رعایت ایمنی زیستی سطح ۲ انجام شود.