محیط کشت PPLO آگار

محیط کشت آگار پی‌پی‌ال‌او (مایکوپلاسما آگار پایه)

محیط کشت PPLO Agar (Pleuropneumonia-Like Organisms Agar) که به نام Mycoplasma Agar Base نیز شناخته می‌شود، یک محیط پایه جامد برای کشت مایکوپلاسماها است. مایکوپلاسماها به دلیل فقدان دیواره سلولی و ناتوانی در سنتز بسیاری از واحدهای ساختمانی ضروری، نیاز به یک محیط بسیار غنی دارند. این محیط پایه حاوی عصاره قلب و پپتون به عنوان منابع پیچیده نیتروژن، کربن، ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه است. با این حال، محیط پایه به تنهایی برای رشد کافی نیست و باید با سرم (معمولاً ۱۰-۲۰٪ سرم اسب یا سرم جنین گاوی) غنی شود. سرم منبع ضروری استرول‌ها (به ویژه کلسترول) و اسیدهای چرب ضروری است که مایکوپلاسماها به دلیل عدم توانایی در سنتز آنها، نیاز به دریافت از محیط دارند. همچنین اغلب مخمر استخراج (Yeast Extract) و DNA به محیط اضافه می‌گردد. محیط نهایی باید دارای pH حدود ۷.۸-۸.۰ باشد که برای اکثر گونه‌ها مناسب است. برای جداسازی اوره‌آپلاسماها، اوره و یک نشانگر pH (مانند فنول رد) نیز افزوده می‌شود. کلونی‌های مایکوپلاسما معمولاً بسیار کوچک (۱۰۰-۳۰۰ میکرومتر) و دارای ظاهر مشخص “تخم مرغ نیمرو” (Fried-egg appearance) هستند، با یک مرکز متراکم که در آگار فرورفته و یک حاشیه صاف و نازک در سطح محیط.

کاربرد اصلی این محیط در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی برای تشخیص عفونت‌های دستگاه تناسلی (مانند M. genitalium, U. urealyticum)، دستگاه تنفسی (مانند M. pneumoniae) و نیز در کنترل کیفیت سلول‌های کشت بافت (برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما) و تحقیقات دامپزشکی است.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، غنی‌شده و تخصصی برای مایکوپلاسما و اوره‌آپلاسما
• هدف کشت: کشت، جداسازی و شناسایی مایکوپلاسماها و اوره‌آپلاسماها از نمونه‌های بالینی، کشت سلولی و حیوانی
• حالت فیزیکی: پودر (حاوی عصاره قلب، پپتون و آگار) که پس از حل کردن، اتوکلاو و خنک شدن، با سرم استریل و سایر افزودنی‌های استریل (مخمر استخراج، DNA، نشانگر) مخلوط و در پلیت ریخته می‌شود.
• ترکیبات کلیدی پایه: عصاره قلب، پپتون، کلرید سدیم، آگار
• غنی‌سازهای ضروری: سرم استریل (۱۰-۲۰٪) (منبع استرول و اسیدهای چرب)، مخمر استخراج، DNA (منبع نوکلئوتید)، پنی‌سیلین G (برای مهار باکتری‌های دارای دیواره)
• افزودنی برای اوره‌آپلاسما: اوره و نشانگر فنل رد (برای تشخیص هیدرولیز اوره که باعث تغییر رنگ به قرمز می‌شود).
• شرایط کشت: نمونه (سواب، مایع بدن، کشت سلولی) مستقیماً روی سطح پلیت کشت داده شده و در شرایط مناسب انکوبه می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: در اتمسفر حاوی ۵-۱۰٪ CO₂ با رطوبت بالا، در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ تا ۱۴ روز (رشد ممکن است کند باشد). برخی گونه‌ها نیاز به انکوباسیون بیهوازی دارند.
• خوانش نتیجه: مشاهده کلونی‌های ریز (۰.۱-۰.۳ میلی‌متر) با ظاهر تخم مرغ نیمرو تحت میکروسکوپ با بزرگنمایی کم (۴۰-۱۰۰X). برای اوره‌آپلاسما: تغییر رنگ محیط به قرمز در اطراف کلونی (هیدرولیز اوره مثبت).
• کنترل کیفیت: سویه Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531: رشد خوب با کلونی‌های مشخص پس از ۵-۱۰ روز. سویه Ureaplasma urealyticum ATCC 27618: رشد با تغییر رنگ محیط به قرمز.
• کاربرد اصلی: روش استاندارد کشت برای تشخیص عفونت‌های مایکوپلاسمایی در بالین انسان و دام، و پایش آلودگی مایکوپلاسما در بانک‌های سلولی و محصولات بیولوژیک.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر پایه PPLO Agar ایبرسکو (IBRESco) را در جای خشک و خنک نگهداری کنید. تمام افزودنی‌ها (سرم، مخمر استخراج، DNA، آنتی‌بیوتیک‌ها) باید استریل و فیلتر شده باشند و پس از اتوکلاو و خنک شدن محیط پایه (۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد) اضافه شوند. هرگز سرم را اتوکلاو نکنید. محیط را به آرامی مخلوط کرده و بلافاصله در پلیت‌های استریل بریزید. پلیت‌های آماده را می‌توان در کیسه‌های پلاستیکی بسته‌بندی و در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد برای مدت کوتاه (۱-۲ هفته) نگهداری کرد. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق رسیده و سطح آنها خشک باشد. کشت مایکوپلاسما دشوار و زمان‌بر است. نمونه‌های بالینی باید سریع پردازش شوند یا در محیط انتقال مخصوص مایکوپلاسما نگهداری گردند. از آنجایی که کلونی‌ها بسیار ریز هستند، مشاهده آنها با چشم غیرمسلح دشوار است و باید از میکروسکوپ معکوس یا استریومیکروسکوپ با بزرگنمایی کم استفاده کرد. برای تأیید، کلونی‌ها را می‌توان به محیط مایع PPLO Broth منتقل کرد یا با تست‌های مولکولی (PCR) شناسایی نمود. کار با مایکوپلاسماهای بیماری‌زای انسانی باید تحت شرایط ایمنی زیستی سطح مناسب انجام شود. برای جلوگیری از آلودگی قارچی، می‌توان از نیستاتین یا آمفوتریسین B در محیط استفاده کرد.