محیط کشت R2A آگار 1

محیط کشت آگار آر ۲ ای (R2A Agar)

محیط کشت R2A Agar یک محیط کم‌غذاتر (Low Nutrient/ Low Carbon) است که به طور خاص برای نظارت میکروبیولوژیکی بر کیفیت آب، به ویژه آب‌های فوق‌خالص (مانند آب قابل تزریق، آب تصفیه‌شده دارویی و آب سیستم‌های خالص‌سازی) فرموله شده است. این محیط با کاهش غلظت کلی مواد مغذی (کربن، نیتروژن) نسبت به محیط‌های استاندارد غنی مانند Plate Count Agar (PCA) و افزودن ترکیبات خاصی مانند پیرووات سدیم (به عنوان آنتی‌اکسیدان برای کاهش استرس اکسیداتیو و احیای سلول‌های آسیب‌دیده)، کازئین هیدرولیزات و عصاره مخمر (به عنوان منابع پیچیده و متعادل نیتروژن) و نیز کربوهیدرات‌های مختلف (گلوکز، نشاسته قابل حل) شرایط بهینه‌ای را برای رشد آرام و تدریجی باکتری‌های اولیگوتروف و آسیب‌دیده (stressed) فراهم می‌آورد. دوره انکوباسیون طولانی‌تر (۵ تا ۷ روز) در دمای پایین‌تر (۲۰ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) به این باکتری‌ها فرصت کافی برای بازیابی و تشکیل کلونی می‌دهد.

این محیط به عنوان روش استاندارد در فارماکوپه اروپا (با نام Medium S)، USP و سایر فارماکوپه‌ها برای شمارش میکروبی کل آب‌های خالص دارویی پذیرفته شده است. همچنین در صنایع غذایی، آرایشی-بهداشتی و کنترل کیفیت سیستم‌های آب دیونیزه و آب فوق‌خالص کاربرد گسترده‌ای دارد. نتایج شمارش با R2A Agar معمولاً به طور قابل توجهی (حتی تا ۱۰۰ برابر) بالاتر از شمارش با PCA برای نمونه‌های آب خالص است، زیرا طیف وسیع‌تری از جمعیت میکروبی حاضر در آن‌ها را آشکار می‌کند.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، کم‌غذاتر (Low Nutrient)، غیرانتخابی، برای شمارش کل میکروارگانیسم‌های زنده.
• هدف کشت: بازیابی، شمارش و رشد باکتری‌های اولیگوتروف، آسیب‌دیده (VBNC) و سایر میکروارگانیسم‌های سخت‌رشد موجود در آب‌های خالص و نمونه‌های با بار میکروبی کم.
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر با کیفیت بالا، حرارت داده شده تا حل شود و سپس اتوکلاو).
• ترکیبات کلیدی: پیرووات سدیم (احیاءکننده/آنتی‌اکسیدان)، کازئین اسید هیدرولیزات، عصاره مخمر، پپتون، گلوکز، نشاسته قابل حل، دی‌پتاسیم فسفات، سولفات منیزیم، آگار. فرمول آن تعادل خاصی از کربن و نیتروژن با غلظت کلی پایین دارد.
• مکانیسم عمل: کاهش استرس اکسیداتیو توسط پیرووات، ارائه منابع متنوع و کم‌غلظت مواد مغذی برای تطابق با نیازهای متابولیک باکتری‌های اولیگوتروف، و اجازه رشد آهسته در دوره انکوباسیون طولانی.
• شرایط کشت: روش شمارش پلیت ریزی Pour Plate یا Spread Plate با حجم نمونه معمولاً ۱ میلی‌لیتر برای آب‌های خالص.
• شرایط انکوباسیون: دمای پایین (۲۰ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) و زمان طولانی (۵ تا ۷ روز، حداقل). برخی استانداردها تا ۱۴ روز را نیز توصیه می‌کنند.
• خوانش نتیجه: شمارش تمام کلونی‌های باکتریایی (و گاهی مخمر/کپک) که پس از دوره انکوباسیون مشخص روی پلیت ظاهر شده‌اند. کلونی‌ها اغلب کوچک، رنگارنگ (سفید، کرم، زرد، صورتی) و با مورفولوژی‌های متنوع هستند.
• کنترل کیفیت: رشد و تشکیل کلونی با سویه‌های مرجع مانند Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027، Escherichia coli ATCC 8739 یا سویه‌های بومی جدا شده از آب. محیط باید عاری از آلودگی باشد. شمارش روی R2A برای یک نمونه آب خالص باید از شمارش روی PCA بیشتر باشد.
• کاربرد اصلی: تست شمارش میکروبی کل (Total Viable Count) آب‌های خالص (آب قابل تزریق، آب تصفیه شده) در صنایع دارویی و پزشکی (مطابق با Ph. Eur.، USP). کنترل کیفیت میکروبی سیستم‌های آب خالص (PW)، آب برای تزریق (WFI) و آب فوق‌خالص (Ultrapure). بررسی کیفیت میکروبی آب در صنایع غذایی و آشامیدنی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر R2A Agar محصول ایبرسکو (IBRESco) باید در جای خشک و خنک نگهداری شود. برای تهیه محیط، حتماً از آب مقطر با کیفیت بالا و عاری از مواد آلی (مانند آب قابل تزریق یا آب تصفیه شده با سیستم RO/DI) استفاده شود تا از آلودگی زمینه‌ای جلوگیری گردد. پس از اتوکلاو، محیط را می‌توان به صورت Pour Plate ریخت یا برای تهیه پلیت‌های پیش‌ساخته استفاده کرد. پلیت‌های آماده را می‌توان در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد به مدت محدود (حدود یک ماه) و در بسته‌بندی محکم برای جلوگیری از خشک شدن نگهداری کرد. قبل از استفاده، پلیت‌ها باید به دمای اتاق برسند و سطح آن‌ها خشک باشد. انکوباسیون طولانی‌مدت ضروری است و پلیت‌ها باید در کیپ‌های پلاستیکی یا کیسه‌های مناسب قرار داده شوند تا از خشک شدن محیط جلوگیری شود. شمارش نهایی معمولاً پس از ۵ تا ۷ روز انجام می‌شود، اما مشاهده در روزهای ۳، ۵ و ۷ می‌تواند مفید باشد. از آنجایی که محیط کم‌غذاست، از تلقیح حجم نمونه بیش از حد (معمولاً ۱ میلی‌لیتر) خودداری شود. برای اطمینان از نتایج معتبر، انجام کنترل‌های منظم کیفی محیط (مانند شمارش پس‌زمینه) و استفاده از تکنیک‌های استریل الزامی است. در صورت نیاز به شناسایی، کلونی‌های مختلف باید به محیط‌های غنی‌تر (مانند TSA) پاس داده شوند.