محیط کشت RVS براث 2

محیط کشت براث راپاپورت واسیلیادیس سویا پپتون (RVS Broth)

محیط کشت Rappaport Vassiliadis Soy Peptone Broth (RVS Broth) یک محیط غنی‌سازی انتخابی قوی است که بر اساس مقاومت ذاتی اکثر سویه‌های سالمونلا به ترکیبات خاصی عمل می‌کند. فرمولاسیون این محیط حاوی کلرید منیزیم در غلظت بالا (برای ایجاد فشار اسمزی و مهار باکتری‌های حساس) و مالاشیت گرین (یک ماده ضد میکروبی) به عنوان عوامل انتخابی اصلی است. این ترکیبات، رشد بسیاری از باکتری‌های گرم مثبت، گرم منفی روده‌ای غیرسالمونلا (مانند E. coli، Proteus) و باکتری‌های سرماگرا (مهم در نمونه‌های غذایی) را مهار می‌کنند. هم‌زمان، سویه‌های سالمونلا معمولاً قادر به تحمل این شرایط استرس‌زا و تکثیر در آن هستند. محیط پایه شامل سویا پپتون و فسفات است که مواد مغذی ضروری را فراهم می‌کنند. RVS Broth به طور خاص برای روش‌های غنی‌سازی با دمای بالا (۴۱٫۵ تا ۴۲ درجه سانتی‌گراد) بهینه شده است که یک عامل انتخابی اضافی محسوب می‌شود و رشد رقیبان باقی‌مانده را بیشتر محدود می‌کند.

این محیط به عنوان یک مرحله کلیدی در بسیاری از پروتکل‌های استاندارد بین‌المللی (مانند ISO 6579-1:2017 برای مواد غذایی و خوراک دام) برای تشخیص سالمونلا پذیرفته شده است. کاربرد اصلی آن در صنایع غذایی، کنترل کیفیت میکروبی مواد اولیه و محیط، و نیز در میکروبیولوژی بالینی (برای نمونه‌های مدفوع) می‌باشد. پس از دوره انکوباسیون، از این کشت غنی‌شده بر روی محیط‌های جامد انتخابی افتراقی مانند XLD Agar یا Rambach Agar برای جداسازی کلونی‌های مشکوک سالمونلا استفاده می‌شود.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: مایع (براث)، غنی‌سازی انتخابی (Selective Enrichment Broth) با قدرت مهارکنندگی بالا.
• هدف کشت: غنی‌سازی انتخابی و افزایش حساسیت تشخیص سالمونلا، به ویژه از نمونه‌های غذایی پیچیده و دارای فلور میکروبی رقیب فراوان.
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود. اتوکلاو نمی‌شود زیرا مالاشیت گرین حرارت‌دیده تجزیه می‌شود. معمولاً به صورت استریل فیلتر شده یا با گرمای ملایم تهیه می‌شود).
• ترکیبات کلیدی انتخابی: مالاشیت گرین (مهارکننده باکتری‌های گرم مثبت و بسیاری از گرم منفی‌ها)، کلرید منیزیم غلیظ (ایجاد فشار اسمزی بالا و مهار باکتری‌های حساس).
• ترکیبات تغذیه‌ای پایه: سویا پپتون (منبع نیتروژن و ویتامین)، دی‌پتاسیم فسفات و مونوپتاسیم فسفات (بافر).
• شرایط انتخابی فیزیکی: انکوباسیون در دمای بالا (۴۱٫۵ ± ۰٫۵ درجه سانتی‌گراد) به مدت ۲۴ ± ۳ ساعت.
• نسبت نمونه به محیط: نسبت رقت بالا (معمولاً ۱:۱۰۰ یا ۱:۱۰) برای رقیق کردن مواد بازدارنده موجود در نمونه و کاهش استرس اولیه روی سالمونلاهای احتمالی. به عنوان مثال، ۰٫۱ میلی‌لیتر از پیش‌غنی‌سازی اولیه به ۱۰ میلی‌لیتر RVS Broth اضافه می‌شود.
• شرایط کشت: پس از اضافه کردن نمونه، لوله‌ها در انکوباتور با دمای کنترل شده دقیق قرار می‌گیرند.
• خوانش نتیجه: مثبت: کدورت قابل مشاهده در محیط براث (نشانه رشد). سپس زیرکشت بر روی محیط جامد انتخابی انجام می‌گیرد. منفی: عدم تغییر (شفاف ماندن محیط).
• کنترل کیفیت: رشد خوب با سویه Salmonella Enteritidis ATCC 13076 (کنترل مثبت). مهار رشد یا رشد ضعیف با سویه Escherichia coli ATCC 25922 (کنترل منفی).
• کاربرد اصلی: مرحله غنی‌سازی انتخابی در پروتکل استاندارد تشخیص سالمونلا در مواد غذایی (گوشت، مرغ، تخم مرغ، سبزیجات، ادویه‌جات)، خوراک دام و نمونه‌های محیطی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Rappaport Vassiliadis Soy Peptone Broth محصول ایبرسکو (IBRESco) باید در جای خشک و خنک نگهداری شود. به دلیل حساسیت مالاشیت گرین به حرارت، محیط را نباید اتوکلاو کرد. محیط باید با حل کردن پودر در آب مقطر جوشانده‌شده و سپس سرد شده (یا با روش‌های استریل فیلتراسیون) تهیه گردد. محلول آماده شده را می‌توان در ظروف استریل در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد، دور از نور، برای مدت محدودی نگهداری کرد. کنترل دقیق دمای انکوباتور در ۴۱٫۵ درجه سانتی‌گراد حیاتی است زیرا دماهای پایین‌تر ممکن است به رشد رقیبان منجر شود. نمونه‌های غذایی معمولاً ابتدا در یک محیط غنی‌سازی غیرانتخابی مانند Buffered Peptone Water (BPW) به مدت ۱۸ ساعت در ۳۷ درجه سانتی‌گراد پیش‌غنی‌سازی می‌شوند و سپس از آن به RVS Broth انتقال می‌یابند. حجم انتقال از پیش‌غنی‌سازی به RVS باید دقیق باشد (معمولاً ۰٫۱ میلی‌لیتر). از لوله‌های دارای درپوش محکم برای جلوگیری از تبخیر در دمای بالا استفاده شود. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون، بلافاصله باید کشت بر روی محیط جامد انتخابی مانند XLD Agar انجام گیرد. ترکیب استفاده از RVS Broth با دمای بالا و محیط MKTTn Broth با دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد، پوشش بهتری برای انواع مختلف سالمونلا فراهم می‌کند. کلیه اقدامات مطابق با پروتکل استاندارد آزمایشگاه انجام شود.