محیط کشت SPS آگار 2

محیط کشت آگار اس‌پی‌اس (Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar)

محیط کشت Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar (SPS Agar) یک محیط انتخابی و افتراقی برای Clostridium perfringens است که بر اساس ویژگی‌های متابولیکی و مقاومت آنتی‌بیوتیکی این باکتری عمل می‌کند. این محیط حاوی سولفیت سدیم و سیترات آهن آمونیوم است. C. perfringens قادر به احیای سولفیت به سولفید در شرایط بی‌هوازی است. سولفید تولید شده با یون آهن واکنش داده و تشکیل رسوب سیاه رنگ سولفید آهن (FeS) می‌دهد که کلونی‌های C. perfringens را به رنگ سیاه درمی‌آورد. دو آنتی‌بیوتیک موجود در محیط، پلی‌میکسین B و سولفادیازین، به عنوان عوامل انتخابی عمل می‌کنند. پلی‌میکسین B رشد بسیاری از باکتری‌های گرم منفی را مهار می‌کند، در حالی که سولفادیازین (یک سولفونامید) مانع رشد بسیاری از باکتری‌های گرم مثبت به جز C. perfringens (که معمولاً مقاوم است) می‌گردد. محیط همچنین حاوی پپتون و عصاره مخمر به عنوان منابع تغذیه‌ای است. این ترکیب، محیط را برای جداسازی انتخابی C. perfringens از نمونه‌های پیچیده (مانند مواد غذایی یا فاضلاب) که حاوی فلور میکروبی متنوعی هستند، ایده‌آل می‌سازد.

کاربرد اصلی آن در میکروبیولوژی غذایی برای بررسی آلودگی مواد غذایی (به ویژه گوشت و مرغ) به C. perfringens به عنوان علت مسمومیت غذایی، و در میکروبیولوژی آب و فاضلاب به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی اخیر است، زیرا این باکتری به صورت اسپور در محیط پایدار می‌ماند.

مشخصات کلیدی

• نوع محیط: جامد (آگار)، انتخابی و افتراقی (بر اساس رنگ سیاه) برای Clostridium perfringens.
• هدف کشت: جداسازی، شمارش و شناسایی اولیه Clostridium perfringens از نمونه‌های غذایی، آب و محیطی.
• حالت فیزیکی: پودر (تهیه شده در آب مقطر، حرارت داده شده تا حل شود و سپس اتوکلاو می‌شود).
• ترکیبات کلیدی افتراقی: سولفیت سدیم (سوبسترا برای احیا)، سیترات آهن آمونیوم (شاخص واکنش با سولفید). نتیجه: تشکیل کلونی‌های سیاه.
• ترکیبات کلیدی انتخابی: پلی‌میکسین B سولفات (مهارکننده باکتری‌های گرم منفی)، سولفادیازین سدیم (مهارکننده طیف وسیعی از باکتری‌های گرم مثبت).
• ترکیبات تغذیه‌ای پایه: پپتون، عصاره مخمر.
• مکانیسم عمل: مهار انتخابی رقیبان توسط آنتی‌بیوتیک‌ها. احیای سولفیت و تشکیل سولفید آهن سیاه رنگ توسط C. perfringens.
• شرایط کشت: کشت عمقی (Pour Plate) روش ترجیحی است. نمونه یا رقت آن با محیط مخلوط شده و در پلیت ریخته می‌شود. یک لایه اُورلی (Overlay) از محیط استریل نیز اغلب برای ایجاد شرایط بی‌هوازی بهتر روی آن ریخته می‌شود.
• شرایط انکوباسیون: شرایط بی‌هوازی مطلق (در ژار با ژنراتور گاز بی‌هوازی یا چمبر) در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت.
• خوانش نتیجه: کلونی‌های Clostridium perfringens معمولاً به صورت سیاه و گاهی با هاله سیاه کوچک در اطراف دیده می‌شوند. کلونی‌های سفید یا بی‌رنگ معمولاً C. perfringens نیستند. شمارش کلونی‌های سیاه انجام می‌شود.
• کنترل کیفیت: رشد خوب و تشکیل کلونی‌های سیاه با سویه Clostridium perfringens ATCC 13124 (کنترل مثبت). مهار رشد یا عدم تشکیل کلونی سیاه با سویه Escherichia coli ATCC 25922 یا Staphylococcus aureus ATCC 25923 (کنترل منفی).
• کاربرد اصلی: شمارش انتخابی Clostridium perfringens در مواد غذایی (مانند گوشت، مرغ، ادویه‌جات) مطابق با استانداردهای معتبر (مانند FDA BAM، ISO 7937)، و بررسی حضور آن به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی در آب و نمونه‌های محیطی.

نکات کاربردی و نگهداری

پودر Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar محصول ایبرسکو (IBRESco) باید در جای خشک و خنک نگهداری شود. برای تهیه، پودر را در آب مقطر حل کرده و به جوش آورید تا کاملاً حل شود. سپس اتوکلاو نمایید. برای روش کشت عمقی، محیط را تا ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد سرد کرده، نمونه یا رقت آن را اضافه کنید، به آرامی مخلوط کرده و در پلیت بریزید. پس از سفت شدن، یک لایه نازک (اُورلی) از محیط استریل SPS یا آب آگار روی آن بریزید تا شرایط بی‌هوازی بهتر ایجاد شود. پلیت‌ها باید بلافاصله در شرایط بی‌هوازی قرار گیرند. دقت کنید که پلیت‌ها به صورت وارونه انکوبه نشوند، زیرا ممکن است قطرات متراکم شده لایه اورلی را بشکنند. انکوباسیون باید دقیقاً در شرایط بی‌هوازی انجام شود. پس از ۱۸-۲۴ ساعت، پلیت‌ها را از نظر کلونی‌های سیاه بررسی کنید. برخی سویه‌های C. perfringens ممکن است کلونی‌های خاکستری (نه کاملاً سیاه) تولید کنند. برای تأیید، می‌توان تست‌های تکمیلی مانند عدم تحرک، واکنش لکتیناز روی آگار خون و تست نیترات-نیتریت انجام داد. از آنجایی که اسپورهای C. perfringens نسبت به حرارت مقاوم هستند، اغلب از یک مرحله شوک حرارتی (۷۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ دقیقه) روی نمونه قبل از کشت برای از بین بردن سلول‌های رویشی و انتخاب اسپورها استفاده می‌شود. محیط SPS ممکن است برخی سویه‌های دیگر کلستریدیوم احیاکننده سولفیت (مانند C. botulinum) را نیز رشد دهد، بنابراین تأیید بیوشیمیایی یا مولکولی توصیه می‌شود.