الایزا
کیت های بیوشیمی
کیت های مولکولی و سایر
کیت های دامپزشکی
کیت های زیبایی
تجهیزات آزمایشگاهی
کیت های تشخیص سریع
مصرفی
دستگاه اسپکتروفتومتر چیست و چگونه کار می کند؟
Spectrophotometer
اسپکتروفتومتر یا طیف سنج نوری دستگاهی است که برای اندازه‌گیری مقدار نور جذب شده توسط یک نمونه در طول‌موج‌های مختلف استفاده می‌شود.
با ادامه مقاله همراه باشید تا با انواع دستگاه اسپکتروفتومتر و نحوه کار طیف سنج نوری آشنا شوید.
فهرست مطالب
مقدمه‌ای بر اسپکتروفتومتر
دستگاه اسپکتروفتومتر میزان نوری را که می‌تواند از نمونه عبور کند اندازه‌گیری می‌کند. دستگاه spectrophotometer شامل یک منبع نور، یک نگهدارنده نمونه، یک توری پراش یا منشور برای جداکردن نور به طول‌موج‌های مختلف آن و یک آشکارساز برای اندازه‌گیری مقدار نور جذب شده در هر طول‌موج است.
اسپکتروفتومتری یک تکنیک استاندارد در بسیاری از آزمایشگاه‌های شیمی است. از داده‌های جمع‌آوری‌شده، یک کامپیوتر طیف جذبی را برای نمونه ترسیم می‌کند. اسپکتروفتومتری عمل استفاده از طیف سنج برای اندازه‌گیری است.
اسپکتروفتومتری شاخه‌ای از طیف‌سنجی الکترومغناطیسی است که به اندازه‌گیری کمی خواص بازتابی یا انتقالی یک ماده به‌عنوان تابعی از طول‌موج مربوط می‌شود. طیف سنج نوری از فوتومترهایی استفاده می‌کند که به طیف سنج نوری معروف هستند که می‌توانند شدت پرتو نور را در طول‌موج‌های مختلف اندازه‌گیری کنند.
اگرچه اسپکتروفتومتری معمولاً برای پرتوهای فرابنفش، مرئی و مادون‌قرمز استفاده می‌شود، اسپکتروفتومترهای مدرن می‌توانند بخش‌های وسیعی از طیف الکترومغناطیسی، از جمله طول‌موج‌های اشعه ایکس، فرابنفش، مرئی، مادون‌قرمز و/یا مایکروویو را بررسی کنند.
در تصویر زیر چند مدل دستگاه اسپکتروفتومتر که معمولاً در آزمایشگاه‌های شیمی یافت می‌شود مشاهد می گردد. دستگاه اسپکتروفتومتر تولید داخل و وارداتی با برندهای مختلف در بازاز موجود است.
اسپکتروفتومتر چیست؟
به زبان ساده، spectrophotometer ابزاری است که به دانشمندان و محققین کمک می‌کند تا خواص نور و نحوه تعامل آن با مواد مختلف را مطالعه کنند. با اندازه‌گیری مقدار نور جذب شده توسط یک نمونه در طول‌موج‌های مختلف، یک طیف سنج نوری می‌تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد ترکیب و خواص نمونه ارائه دهد.
دستگاه اسپکتروفتومتر می‌تواند ابزار مفیدی برای انجام آزمایش‌ها و مطالعه خواص نور و ماده باشد. به‌عنوان‌مثال، یک دانش‌آموز می‌تواند از یک اسپکتروفتومتر (طیف سنج نوری) برای مطالعه طیف جذب یک محلول استفاده کند که الگوی جذب نور در طول‌موج‌های مختلف است. با تجزیه‌وتحلیل طیف جذب یک محلول، دانش‌آموز می‌تواند با ترکیب و خواص محلول آشنا شود.
ایده اصلی اسپکتروفتومتری این است که نور از یک نمونه عبور می‌کند و شدت پرتو قبل و بعد از نمونه مقایسه می‌شود. نمونه‌های مختلف نور را متفاوت جذب می‌کنند و اجازه می‌دهند مقادیر متفاوتی از رنگ‌های مختلف نور عبور کند.
این روش کار می‌کند؛ زیرا هر مولکول نور را جذب می‌کند. بسته به مولکول‌ها، رنگ‌های خاصی را بیشتر از بقیه جذب می‌کند.
به‌عنوان‌مثال، طیف‌سنجی در طول‌موج‌های مرئی ساده‌ترین نوع برای تجسم است. یک نمونه سیاه‌رنگ به‌طورکلی تمام‌رنگ‌های نور مرئی را جذب می‌کند. به همین دلیل است که سیاه به نظر می‌رسد. از طرف دیگر، اگر تمام طول‌موج‌های نور مرئی از نمونه عبور کند، نمونه به‌احتمال زیاد سفید به نظر می‌رسد.
به‌طورکلی، طیف سنج نوری یک ابزار قدرتمند و همه‌کاره است که در بسیاری از زمینه‌های مختلف از جمله شیمی، زیست‌شناسی و علم مواد استفاده می‌شود. این به دانشمندان و محققان اجازه می دهد تا خواص نور و نحوه تعامل آن با مواد مختلف را مطالعه کنند و بینش و اطلاعات ارزشمندی را ارائه دهند.
کلمه اسپکتروفتومتر از کجا آمده است؟
ما می‌توانیم بخش‌های کلمه spectrophotometer را تجزیه کنیم تا به یادآوری معنای کلمه کمک کنیم. “طیف” از انرژی تابشی یا انرژی نور می‌آید. بخش بعدی، «عکس» به نور اشاره دارد و در نهایت، “متر” به یک ابزار یا ابزار اندازه‌گیری اشاره دارد.
اسپکتروفتومتر چگونه کار می‌کند؟
ساده‌ترین طیف سنج شامل یک منبع نور، یک نگهدارنده نمونه و یک آشکارساز است.
منبع نور فوتون‌هایی را تولید می‌کند که از نمونه عبور می‌کنند. نوع دقیق منبع نور به طول‌موج نور موردنیاز بستگی دارد. بسته به منبع، یک کولیماتور و منشور طول‌موج صحیح را انتخاب می‌کنند.
نور بعد با نمونه تعامل می‌کند. یک کووت کوارتز نمونه‌ها را نگه می‌دارد. کووت قطعه‌ای تخصصی از ظروف شیشه‌ای با عرض و جنس بسیار دقیق است. مواد نگهدارنده نمونه مهم است. شما نمی‌خواهید از نگهدارنده نمونه استفاده کنید که در طول‌موج نور مورد بررسی شما نیز جذب شود.
همچنین به همین دلیل است که بهترین تمرین اجرای یک خالی/پس‌زمینه در ساز با یک کووت خالی است. طول مسیر از طریق کووت نیز یک پارامتر مهم برای برخی از محاسبات است. طول مسیر مقدار نمونه‌ای است که نور از آن عبور می‌کند؛ بنابراین یک کووت که ۱ سانتی متر عرض دارد، طول مسیر آن ۱ سانتی متر است.
در تصویر زیر نمودار ساده یک دستگاه اسپکتروفتومتر جذبی مشاهده می شود.
پس از عبور نور از نمونه، به آشکارساز حرکت می‌کند. مشابه منبع نور، آشکارساز دقیق به طول‌موج نور بستگی دارد. برخی از رایج‌ترین آشکارسازها، لوله‌های فتو ضربی و فوتودیودها هستند. آشکارساز تعداد فوتون‌هایی را که به آن می‌رسند شمارش می‌کند. آشکارساز به رایانه‌ای متصل می‌شود که این داده‌ها را ترسیم می‌کند. این نمودار طیف جذبی نامیده می‌شود. این نمودار شدت نور با طول‌موج نور است. نمونه‌ای از آنچه که طیف جذبی به نظر می‌رسد در زیر مشاهده می‌شود.
ویژگی های دستگاه اسپکتروفتومتر
ویژگی‌های مهم spectrophotometer عبارتند‌از:
- پهنای باند طیفی (محدوده رنگی که می‌تواند از طریق نمونه آزمایشی منتقل کند)
- درصد انتقال نمونه
- محدوده لگاریتمی جذب نمونه و گاهی اوقات درصدی از اندازه‌گیری بازتاب.
کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه اسپکتروفتومتر ابزاری است که بر اساس آنالیز کمی مولکول‌ها بسته به میزان جذب نور توسط ترکیبات رنگی بستگی دارد. دستگاه اسپکتروفتومتر معمولاً برای اندازه‌گیری ضریب عبور یا بازتاب محلول‌ها، جامدات شفاف یا مات مانند شیشه صیقلی یا گازها استفاده می‌شود.
اگرچه بسیاری از بیوشیمیایی‌ها رنگی هستند، اما نور مرئی را جذب می‌کنند و بنابراین می‌توان آنها را با روش‌های رنگ‌سنجی اندازه‌گیری کرد، حتی مواد بیوشیمیایی بی‌رنگ اغلب می‌توانند به ترکیبات رنگی مناسب برای واکنش‌های تشکیل‌دهنده رنگ کروموژنیک تبدیل شوند تا ترکیبات مناسب برای آنالیز رنگ‌سنجی تولید کنند.
بااین‌حال، آنها همچنین می‌توانند برای اندازه‌گیری میزان انتشار در هر یک از محدوده‌های نوری ذکر شده که معمولاً حدود ۲۰۰ تا ۲۵۰۰ نانومتر را با استفاده از کنترل‌ها و کالیبراسیون‌های مختلف پوشش می‌دهند، طراحی شوند. در این محدوده نور، کالیبراسیون‌هایی روی ماشین با استفاده از استانداردهایی که بسته به طول‌موج تعیین فتومتریک از نظر نوع متفاوت است، موردنیاز است.
استفاده از اسپکتروفتومترها حوزه های علمی مختلفی مانند فیزیک، علم مواد، شیمی، بیوشیمی، مهندسی شیمی، و زیست‌شناسی مولکولی را در بر می‌گیرد. آنها به طور گسترده در بسیاری از صنایع از جمله نیمه‌هادی‌ها، تولید لیزر و نوری، چاپ و معاینه پزشکی قانونی و همچنین در آزمایشگاه‌ها برای مطالعه مواد شیمیایی استفاده می‌شوند.
دستگاه اسپکتروفتومتر اغلب در اندازه‌گیری فعالیت‌های آنزیم، تعیین غلظت پروتئین، تعیین ثابت‌های جنبشی آنزیمی، و اندازه‌گیری واکنش‌های اتصال لیگاند استفاده می‌شود. مواد در یک هدف و دقیقاً چقدر از طریق محاسبات طول‌موج‌های مشاهده شده وجود دارند.
در نجوم، اصطلاح طیف‌سنجی به اندازه‌گیری طیف یک جرم آسمانی اشاره دارد که در آن مقیاس شار طیف به‌عنوان تابعی از طول‌موج کالیبره می‌شود، معمولاً در مقایسه با مشاهده یک ستاره استاندارد طیف‌سنجی، و برای جذب تصحیح می‌شود. نور توسط جو زمین.
اساس کار با اسپکتروفتومتر
نمونه‌ای از آزمایشی که در آن از اسپکتروفتومتری استفاده می‌شود، تعیین ثابت تعادل یک محلول است. یک واکنش شیمیایی خاص در یک محلول ممکن است در جهت روبه‌جلو و معکوس رخ دهد، جایی که واکنش‌دهنده‌ها محصولات را تشکیل می‌دهند و محصولات به واکنش‌دهنده‌ها تجزیه می‌شوند. در نقطه‌ای، این واکنش شیمیایی به نقطه تعادلی به نام نقطه تعادل می‌رسد.
به‌منظور تعیین غلظت مربوط به واکنش‌دهنده‌ها و محصولات در این نقطه، عبور نور محلول را می‌توان با استفاده از طیف سنج نوری آزمایش کرد. مقدار نوری که از محلول عبور می‌کند، نشان‌دهنده غلظت برخی از مواد شیمیایی است که اجازه عبور نور را نمی‌دهند.
جذب نور به دلیل برهمکنش نور باحالت‌های الکترونیکی و ارتعاشی مولکول‌ها است. هر نوع مولکول دارای مجموعه‌ای از سطوح انرژی است که با ساختار پیوندهای شیمیایی و هسته‌های آن مرتبط است و بنابراین نور با طول‌موج‌ها یا انرژی‌های خاص را جذب می‌کند و در نتیجه خواص طیفی منحصربه‌فردی دارد. این بر اساس آرایش خاص و متمایز آن است.
تاریخچه
دستگاه اسپکتروفتومتر که توسط آرنولد او. بکمن در سال ۱۹۴۰ اختراع و با کمک همکارانش در شرکت آزمایشگاه فنی ملی او که در سال ۱۹۳۵ تأسیس شد، ساخته شد که به شرکت ابزار بکمن و در نهایت بکمن کولتر تبدیل شد. این به‌عنوان راه‌حلی برای اسپکتروفتومترهای ساخته شده قبلی است که قادر به جذب صحیح اشعه ماورای‌بنفش نیستند. او با اختراع و توسعه چند مدل از این دستگاه این اختراع را تکمیل کرد.
مدل A: ابتدا با ساخت مدل A شروع کرد که در آن از یک منشور شیشه‌ای برای جذب نور UV استفاده شد. اما نتایج بدست آمده از این مدل رضایت بخش نبود.
مدل B: در مدل B، با تغییر از یک شیشه به یک منشور کوارتز باعث نتایج جذب بهتر شد.
مدل C: در مرحله بعد با فراهم کردن امکان تنظیم در وضوح طول‌موج پیشترفت بیشتری حاصل شد که در نهایت سه واحد از آن تولید شد.
مدل D: آخرین و محبوب‌ترین نوع آن، مدل D بود که اکنون به‌عنوان اسپکتروفتومتر DU شناخته می‌شود که حاوی جعبه‌ابزار، لامپ هیدروژنی با پیوستگی ماورای‌بنفش و یک تک‌رنگ بهتر است. این مدل از سال ۱۹۴۱ تا ۱۹۷۶ تولید شد که قیمت آن در سال ۱۹۴۱ ۷۲۳ دلار آمریکا بود (لوازم جانبی دور اشعه ماورای‌بنفش یک گزینه با هزینه اضافی بودند).
به قول بروس مری فیلد، برنده جایزه نوبل شیمی، «spectrophotometer احتمالاً مهم‌ترین ابزاری بود که تابه‌حال برای پیشرفت علم زیستی ساخته شده است».
تحول بعدی در ساخت طیف سنج نوری توسط هیولت پاکارد انجام شد و او اولین طیف سنج آرایه دیودی تجاری در دسترس را در سال ۱۹۷۹ به نام HP 8450A ایجاد کرد. طیف‌سنج‌های آرایه‌ای دیودی با اسپکتروفتومتر اصلی ساخته شده توسط بکمن متفاوت بودند، زیرا اولین طیف سنج نوری کنترل‌شده توسط ریزپردازنده تک پرتویی بود که چندین طول‌موج را در یک زمان در ثانیه اسکن می‌کرد.
در این دستگاه به نمونه با نور چند رنگی تابش می‌کند که نمونه بسته به خواص آن را جذب می‌کند. سپس با رنده کردن آرایه فوتودیود که منطقه طول‌موج طیف را تشخیص می دهد، به عقب منتقل (فیدبک) می‌شود. از آن زمان، ایجاد و اجرای دستگاه اسپکتروفتومتری به شدت افزایش یافته و به یکی از نوآورانه ترین ابزارهای زمان ما تبدیل شده است.
طراحی اسپکتروفتومتر
دودسته اصلی از دستگاه‌ها وجود دارد: تک پرتو و دو پرتو. یک spectrophotometer دو پرتو شدت نور را بین دو مسیر نور مقایسه می‌کند، یک مسیر حاوی نمونه مرجع و دیگری نمونه آزمایشی است.
یک اسپکتروفتومتر تک پرتو، شدت نور نسبی پرتو را قبل و بعد از قراردادن نمونه آزمایشی اندازه‌گیری می‌کند. اگرچه اندازه‌گیری‌های مقایسه از ابزارهای دو پرتو آسان‌تر و پایدارتر هستند، ابزارهای تک پرتو می‌توانند دامنه دینامیکی بزرگ‌تری داشته باشند و از نظر نوری ساده‌تر و فشرده‌تر هستند. علاوه بر این، برخی از ابزارهای تخصصی، مانند اسپکتروفتومترهای ساخته شده بر روی میکروسکوپ یا تلسکوپ، به دلیل کاربردی‌بودن، ابزارهای تک پرتو هستند.
از نظر تاریخی، اسپکتروفتومترها از یک تک‌رنگ حاوی یک توری پراش برای تولید طیف تحلیلی استفاده می‌کنند. توری می‌تواند متحرک یا ثابت باشد. اگر از یک آشکارساز منفرد، مانند لوله فتو ضربی یا فوتودیود استفاده شود، گریتینگ را می‌توان به‌صورت مرحله‌ای اسکن کرد (اسکن اسپکتروفتومتر) تا آشکارساز بتواند شدت نور را در هر طول‌موج اندازه‌گیری کند (که با هر “گام” مطابقت دارد).
آرایه‌های آشکارساز (طیف فتومتر آرایه‌ای)، مانند دستگاه‌های کوپل شده شارژ (CCD) یا آرایه‌های فوتو دیود (PDA) نیز می‌توانند استفاده شوند. در چنین سیستم‌هایی، گریتینگ ثابت است و شدت هر طول‌موج نور توسط یک آشکارساز متفاوت در آرایه اندازه‌گیری می‌شود.
علاوه بر این، اکثر طیف‌سنج‌های مدرن مادون‌قرمز میانی از تکنیک تبدیل فوریه برای به‌دست‌آوردن اطلاعات طیفی استفاده می‌کنند. این تکنیک طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه نامیده می‌شود.
هنگام انجام اندازه‌گیری‌های انتقال، spectrophotometer کسر نوری را که از یک محلول مرجع و یک محلول آزمایشی عبور می‌کند به‌صورت کمی مقایسه می‌کند، سپس به‌صورت الکترونیکی شدت دو سیگنال را مقایسه می‌کند و درصد انتقال نمونه را در مقایسه با استاندارد مرجع محاسبه می‌کند. برای اندازه‌گیری بازتاب، طیف سنج نوری به طور کمی کسر نوری را که از نمونه‌های مرجع و آزمایش منعکس می‌شود، مقایسه می‌کند.
نور لامپ منبع از طریق یک تک‌رنگ عبور می‌کند که نور را به یک “رنگین‌کمان” از طول‌موج‌ها از طریق یک منشور دوار پراکنده می‌کند و از طریق یک شکاف مکانیکی در سمت خروجی تک‌رنگ، پهنای باند باریکی از این طیف پراکنده را خروجی می دهد. این پهنای باند از طریق نمونه آزمایشی منتقل می‌شود. سپس چگالی شار فوتون (معمولاً وات بر مترمربع) نور ارسالی یا بازتاب شده با یک فتودید، دستگاه جفت شارژ یا سنسور نور دیگر اندازه‌گیری می‌شود.
سپس مقدار گذر یا بازتاب برای هر طول‌موج نمونه آزمایشی با مقادیر انتقال یا بازتاب از نمونه مرجع مقایسه می‌شود. اکثر ابزارها برای محاسبه «جذب» نمونه، یک تابع لگاریتمی را به نسبت عبور خطی اعمال می‌کنند، مقداری که متناسب با «غلظت» ماده شیمیایی اندازه‌گیری شده است.
مراحل اسپکتروفتومتر روبشی
به طور خلاصه، توالی رویدادها در یک دستگاه اسپکتروفتومتر روبشی به شرح زیر است:
- منبع نور به یک تک‌رنگ تابیده می‌شود، به رنگین‌کمان پراکنده می‌شود و به دو پرتو تقسیم می‌شود. سپس از طریق نمونه و محلول‌های مرجع اسکن می‌شود.
- کسری از طول‌موج‌های فرودی از طریق نمونه و مرجع منتقل می‌شود یا از آن منعکس می‌شود.
- نور حاصل به دستگاه ردیاب نوری برخورد می‌کند که شدت نسبی دو پرتو را با هم مقایسه می‌کند.
- مدارهای الکترونیکی جریان‌های نسبی را به درصدهای انتقال خطی و/یا مقادیر جذب/غلظت تبدیل می‌کنند.
کاربردها در بیوشیمی
اسپکتروفتومتری تکنیک مهمی است که در بسیاری از آزمایش‌های بیوشیمیایی استفاده می‌شود که شامل جداسازی DNA، RNA و پروتئین، سینتیک آنزیم‌ها و آنالیزهای بیوشیمیایی می‌شود. ازآنجایی‌که نمونه‌های موجود در این برنامه‌ها به‌راحتی در مقادیر زیاد در دسترس نیستند، به‌ویژه برای تجزیه‌وتحلیل در این تکنیک غیرمخرب مناسب هستند.
علاوه بر این، نمونه گران‌بها را می‌توان با استفاده از یک پلت فرم با حجم کوچک که در آن به‌اندازه ۱uL نمونه برای تجزیه‌وتحلیل کامل موردنیاز است، ذخیره کرد. توضیح مختصری از روش اسپکتروفتومتری شامل مقایسه جذب نمونه خالی که حاوی ترکیب رنگی نیست با نمونه‌ای که حاوی ترکیب رنگی است می‌باشد.
این رنگ‌آمیزی را می‌توان با رنگ‌هایی مانند رنگ Coomasie Brilliant Blue G-250 که در طول‌موج ۵۹۵ نانومتر اندازه‌گیری شده است یا با واکنش آنزیمی بین β-گالاکتوزیداز و ONPG (نمونه زرد می‌شود) با اندازه‌گیری ۴۲۰ نانومتر انجام داد.
دستگاه اسپکتروفتومتر برای اندازه‌گیری ترکیبات رنگی در ناحیه مرئی نور (بین ۳۵۰ نانومتر تا ۸۰۰ نانومتر) استفاده می‌شود، بنابراین می‌توان از آن برای یافتن اطلاعات بیشتر در مورد ماده مورد مطالعه استفاده کرد. در آزمایش‌های بیوشیمیایی، یک ویژگی شیمیایی و/یا فیزیکی انتخاب می‌شود و روشی که استفاده می‌شود مختص آن ویژگی است تا اطلاعات بیشتری در مورد نمونه به دست آید، مانند کمیت، خلوص، فعالیت آنزیم و غیره. می‌توان از اسپکتروفتومتری استفاده کرد.
برای تعدادی از تکنیک‌ها مانند تعیین طول‌موج بهینه جذب نمونه‌ها، تعیین pH بهینه برای جذب نمونه‌ها، تعیین غلظت نمونه‌های ناشناخته، و تعیین pKa نمونه‌های مختلف. خالص‌سازی پروتئین و همچنین می‌تواند به‌عنوان روشی برای ایجاد سنجش های نوری یک ترکیب استفاده شود. داده‌های اسپکتروفتومتری همچنین می توانند در رابطه با معادله بیر-لامبرت استفاده شوند.
برای تعیین روابط مختلف بین انتقال و غلظت، و جذب و غلظت. از آنجایی که یک spectrophotometer طول‌موج یک ترکیب را از طریق رنگ آن اندازه می‌گیرد، می‌توان یک ماده اتصال دهنده رنگ به آن اضافه کرد تا بتواند تغییر رنگ دهد و اندازه‌گیری شود. با استفاده از طیف جذبی محلول های استاندارد هر جزء می‌توان غلظت یک مخلوط دو جزئی را دانست.
برای این کار باید ضریب خاموشی این مخلوط را در دو طول‌موج و ضرایب خاموشی محلول هایی که حاوی وزن های شناخته شده دو جزء هستند، دانست. علاوه بر مدل سنتی قانون Beer-Lamberts، می‌توان از طیف‌سنجی بدون برچسب مبتنی بر کووت استفاده کرد که یک فیلتر نوری را در مسیرهای نور اضافه می‌کند و اسپکتروفتومتر را قادر می‌سازد غلظت، اندازه و ضریب شکست نمونه‌ها را طبق قانون عقربه‌ها تعیین کند.
«دستگاه های طیف سنج نوری»در طول دهه ها توسعه یافته و بهبود یافته اند و به طور گسترده در بین شیمیدانان مورد استفاده قرار گرفته اند. علاوه بر این، اسپکتروفتومترها برای اندازه‌گیری مقادیر جذب طول‌موج نور مرئی یا UV تخصصی هستند. این ابزار بسیار دقیقی در نظر گرفته می‌شود که همچنین بسیار حساس و در نتیجه بسیار دقیق است، به ویژه در تعیین تغییر رنگ. این روش همچنین برای استفاده در آزمایشات آزمایشگاهی مناسب است زیرا فرآیندی ارزان و نسبتا ساده است.
طیف جذبی رودامین B از یک اسپکتروفتومتر
نمونه ای از طیف جذبی رسم شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در تصویر زیر مشاهده می گردد.
انواع spectrophotometer
رایج‌ترین انواع spectrophotometer معرفی می گردد.
طیف‌سنج‌ها به‌طورکلی بر اساس طول‌موج نور منبع طبقه‌بندی می‌شوند. دو طبقه‌بندی اصلی وجود دارد:
اسپکتروفتومتر UV-Vis
طیف سنج نوری UV-Vis معمولاً فقط “UV-Vis” نامیده می‌شود. این ابزار جذب را در محدوده فرابنفش و مرئی اندازه‌گیری می‌کند. به‌طورکلی، در محدوده ۲۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر است.
بیشتر اسپکتروفتومترها در نواحی UV و مرئی طیف استفاده می‌شوند و برخی از این ابزارها در ناحیه مادون‌قرمز نزدیک نیز کار می‌کنند. غلظت یک پروتئین را می‌توان با اندازه‌گیری OD در ۲۸۰ نانومتر به دلیل وجود تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین تخمین زد.
این روش چندان دقیق نیست زیرا ترکیب پروتئین‌ها بسیار متفاوت است و پروتئین هایی که هیچ یک از این اسیدهای آمینه ندارند حداکثر جذب را در ۲۸۰ نانومتر ندارند. آلودگی اسید نوکلئیک نیز می‌تواند تداخل ایجاد کند. این روش به یک دستگاه اسپکتروفتومتر نیاز دارد که بتواند در ناحیه UV با کووت های کوارتز اندازه‌گیری کند.
طیف‌سنجی مرئی فرابنفش (UV-vis) شامل سطوح انرژی است که انتقال‌های الکترونیکی را تحریک می‌کند. جذب نور UV-vis، مولکول‌هایی را که در حالت پایه هستند به حالت برانگیخته خود تحریک می‌کند.
اسپکتروفتومتری ناحیه مرئی ۴۰۰-۷۰۰ نانومتر به طور گسترده در علم رنگ سنجی استفاده می‌شود. این یک واقعیت شناخته شده است که بهترین عملکرد را در محدوده ۰.۲-۰.۸ O.D دارد. تولیدکنندگان جوهر، شرکت های چاپ، فروشندگان منسوجات و بسیاری دیگر، به داده‌های ارائه شده از طریق رنگ سنجی نیاز دارند.
آنها در ناحیه هر ۵ تا ۲۰ نانومتر در امتداد ناحیه مرئی خوانش می‌کنند و یک منحنی بازتاب طیفی یا یک جریان داده برای ارائه های جایگزین تولید می‌کنند. این منحنی ها را می‌توان برای آزمایش دسته جدیدی از رنگ استفاده کرد تا بررسی شود که آیا مطابق با مشخصات، به‌عنوان مثال، استانداردهای چاپ ISO است یا خیر.
اسپکتروفتومترهای منطقه مرئی سنتی نمی‌توانند تشخیص دهند که رنگ یا ماده پایه دارای فلورسانس است یا خیر. اگر مثلاً یک یا چند جوهر چاپ فلورسنت باشد، می‌تواند مدیریت مشکلات رنگ را دشوار کند. در جایی که یک‌رنگ حاوی فلورسانس است، از اسپکتروفتومتر فلورسنت دو طیفی استفاده می‌شود. دو راه‌اندازی اصلی برای اسپکتروفتومترهای طیف بصری وجود دارد، d/8 (کروی) و ۰/۴۵. این نام ها به دلیل هندسه منبع نور، ناظر و فضای داخلی اتاق اندازه‌گیری است.
دانشمندان از این ابزار برای اندازه‌گیری مقدار ترکیبات موجود در یک نمونه استفاده می‌کنند. اگر ترکیب بیشتر متمرکز باشد نور بیشتری توسط نمونه جذب می‌شود. در محدوده های کوچک، قانون بیر-لامبرت برقرار است و جذب بین نمونه‌ها با غلظت به صورت خطی متفاوت است. در مورد اندازه‌گیری‌های چاپ معمولاً از دو تنظیم جایگزین استفاده می‌شود – بدون / با فیلتر UV برای کنترل بهتر تأثیر روشن کننده های UV در داخل کاغذ.
طیف سنج میکرو حجمی
طیف سنج میکرو حجمی METTLER TOLEDO UV5Nano
نمونه‌ها معمولاً در کووت‌ها تهیه می‌شوند. بسته به منطقه موردنظر، آنها ممکن است از شیشه، پلاستیک (منطقه طیف مرئی موردعلاقه) یا کوارتز (منطقه موردعلاقه طیف UV دور) ساخته شوند. برخی از برنامه‌ها به اندازه‌گیری حجم کمی نیاز دارند که می‌تواند با پلتفرم‌های میکرو حجم انجام شود.
برنامه‌های کاربردی
- تخمین غلظت کربن آلی محلول
- جذب ویژه اشعه ماورای‌بنفش برای متریک آروماتیک بودن
- تست Bial برای غلظت پنتوزها
کاربرد تجربی
همان‌طور که در بخش برنامه‌ها توضیح داده شد، اسپکتروفتومتری را می‌توان در تجزیه‌وتحلیل کیفی و کمی DNA، RNA و پروتئین‌ها استفاده کرد. می‌توان از تجزیه‌وتحلیل کیفی استفاده کرد و از اسپکتروفتومترها برای ثبت طیف ترکیبات با اسکن مناطق با طول‌موج گسترده برای تعیین خواص جذب (شدت رنگ) ترکیب در هر طول‌موج استفاده می‌شود.
یکی از آزمایش‌هایی که می‌تواند کاربردهای مختلفی را که اسپکتروفتومتری مرئی می‌تواند داشته باشد نشان دهد، جداسازی β-گالاکتوزیداز از مخلوطی از پروتئین‌های مختلف است. به طور عمده، اسپکتروفتومتری بهترین استفاده را برای کمک به کمیت میزان خالص‌سازی نمونه شما نسبت به غلظت کل پروتئین است.
با اجرای کروماتوگرافی میل ترکیبی، B-Galactosidase را می‌توان جدا کرد و با واکنش نمونه‌های جمع‌آوری‌شده با Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) و تعیین اینکه آیا نمونه زرد می‌شود، جدا و آزمایش کرد. ۴۲۰ نانومتر برای برهمکنش خاص با ONPG و در ۵۹۵ برای سنجش برادفورد، مقدار خالص‌سازی را می‌توان به صورت کمی ارزیابی کرد. به منظور خالص‌سازی و جداسازی نمونه‌های مختلف پروتئین.
اسپکتروفتومتر IR
طیف سنج نوری IR نمونه‌ها را با استفاده از نور مادون‌قرمز، ۷۰۰-۱۵۰۰۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌کند.
اسپکتروفتومترهای طراحی شده برای ناحیه مادون‌قرمز به دلیل الزامات فنی اندازه‌گیری در آن ناحیه کاملاً متفاوت هستند. یکی از عوامل اصلی، نوع حسگرهای نوری است که برای مناطق طیفی مختلف در دسترس هستند، اما اندازه‌گیری مادون‌قرمز نیز چالش‌برانگیز است، زیرا تقریباً همه چیز مادون‌قرمز را به‌عنوان تشعشع حرارتی ساطع می‌کند، مخصوصاً در طول‌موج‌های فراتر از حدود ۵ میکرومتر.
عارضه دیگر این است که تعداد کمی از مواد مانند شیشه و پلاستیک مادون‌قرمز را جذب می‌کنند و آن را به‌عنوان یک محیط نوری ناسازگار می‌کنند. مواد نوری ایده‌آل نمک‌هایی هستند که به‌شدت جذب نمی‌شوند. نمونه‌های اسپکتروفتومتری IR را می‌توان بین دو دیسک برومید پتاسیم آغشته کرد یا با برومید پتاسیم آسیاب کرد و در قالب یک گلوله فشرده کرد. در جایی که محلول‌های آبی قرار است اندازه‌گیری شوند، از کلرید نقره نامحلول برای ساخت سلول استفاده می‌شود.
طیف رادیومترها
طیف‌سنج‌هایی که تقریباً مانند طیف‌سنج‌های ناحیه مرئی عمل می‌کنند، برای اندازه‌گیری چگالی طیفی روشن‌کننده‌ها طراحی شده‌اند. برنامه‌ها ممکن است شامل ارزیابی و طبقه‌بندی روشنایی برای فروش توسط سازنده باشد، یا اینکه مشتریان تأیید کنند لامپی که تصمیم به خرید دارند مطابق با مشخصات آنها است. اجزاء:
- منبع نور به نمونه یا از طریق آن می‌تابد.
- نمونه نور را منتقل یا منعکس می‌کند.
- آشکارساز تشخیص می دهد که چه مقدار نور از نمونه منعکس شده یا از طریق آن منتقل شده است.
- سپس آشکارساز مقدار نوری را که نمونه ارسال یا بازتاب کرده است به عدد تبدیل می‌کند.
کاربردهای طیف جذبی
طیف‌های جذبی کاربردهای ممکن متفاوتی دارند:
تعیین غلظت ناشناخته: برای تعیین غلظت محلولی با غلظت ناشناخته می‌توان از طیف‌های جذبی استفاده کرد. داده‌های جذب مجموعه‌ای از محلول‌ها با غلظت‌های شناخته شده، منحنی جذب را ایجاد می‌کند. سپس محلول مجهول را می‌توان با این منحنی مقایسه کرد تا غلظت آن را تعیین کرد. این قانون به نام بیر-لامبرت نیز شناخته می‌شود.
شناسایی یک ماده: هر ماده خالص بسته به ساختار مولکول، طیف جذب منحصربه‌فردی خواهد داشت؛ بنابراین، یک طیف جذبی به شناسایی ناشناخته کمک می‌کند.
شناسایی گروه‌های عملکردی موجود: برخی از گروه‌های عملکردی دارای علائم طیفی مجزا هستند. شناسایی اینها در یک طیف می‌تواند نشان دهد که آیا آن گروه عملکردی وجود دارد یا خیر و آزمایش موفقیت‌آمیز بودن یک واکنش.
محاسبات اسپکتروفتومتری
چند محاسبات کلیدی برای طیف‌سنجی جذبی وجود دارد.
فرمول انتقال:
محاسبه انتقال
جهت محاسبه انتقال از فرمول انتقال (انتقال = شدت نور پس از عبور از نمونه تقسیم بر شدت نور قبل از عبور از نمونه)
در رابطه فوق T انتقال است، Lt شدت نور پس از عبور از نمونه، و L0 شدت نور قبل از نمونه است.
میزان جذب
محاسبه جذب بر اساس اندازه‌گیری‌های انتقال انجام می شود و برابر است با منفی لگاریتم انتقال. میزان جذف با فرمول زیر به انتقال مربوط می‌شود:
- https://chemistrytalk.org/spectrophotometer-chemistry-instrument/
https://en.wikipedia.org/wiki/Spectrophotometry
عالی! این پست واقعاً قابل توجه است، من ایده بسیار روشنی در مورد این پست دریافت کردم.