الایزا
کیت های بیوشیمی
کیت های مولکولی و سایر
کیت های دامپزشکی
کیت های زیبایی
تجهیزات آزمایشگاهی
کیت های تشخیص سریع
مصرفی
فهرست مطالب
معرفی روش های شمارش دستی سلول های خونی
Complete Blood Count
هموسیتومتر
CBC چیست؟
شمارش دستی سلول های خونی چگونه انجام می شود؟
آزمایش CBC به روش دستی چه کاربردی دارد؟
لام نئوبار و هموستومتر چیست؟
تا پایان مقاله، همراه تستا باشید تا علاوه بر پاسخ سوالات فوق اطلاعات کاملی در خصوص شمارش دستی سلول های خونی کسب نمایید.
مقدمه
طور معمول در یکسری آزمایشات درخواستی توسط پزشک، بندرت ممکن است به آزمایش CBC (Complete Blood Count) برنخوریم. همانگونه که از نامش پیداست، بمعنی شمارش تمام سلول ها، تعیین درصد لکوسیت ها، اندازه گیری هموگلوبین و هماتوکریت و تعیین تمام اندکس های گلبول قرمزمی باشد.
تمامی موارد ذکر شده، امروزه توسط دستگاه های سلکانتر بطور اتوماتیک شمارش و اندازه گیری می شوند. با این وجود آگاهی از روش های شمارش دستی سلول های خونی (آزمایش CBC به روش دستی) و همچنین آشنایی با محدودیت های این روش ها برای هر تکنولوژیست آزمایشگاهی، امری ضروری می باشد.
ضمن اینکه شمارش سلول ها در مایعات بدن به روش اتوماتیک نیاز به دستگاه های پیشرفته و گران قیمت دارد و بنابراین در اکثر مراکز تشخیصی، از روش های شمارش دستی سلول های خونی برای شمارش گلبول های قرمز و سفید در مایعات بدن استفاده می شود.
شمارش دستی سلول های خونی
شمارش گلبول های سفید به روش دستی، جایگزین مناسبی برای دستگاه های سلکانترمی باشد ولی برای شمارش گلبول های قرمز و پلاکت ها کاربرد چندانی نداشته و ممکن است با خطای بالا همراه باشد. زیرا که در شرایط معمول در آزمایش CBC به روش دستی، حدود ۴۰۰ گلبول قرمز شمارش شده که موجب عدم دقت بالا در شمارش این سلول ها خواهد شد.
هموسیتومتر چیست؟
روش پیشنهادی برای شمارش دستی سلول های خونی، استفاده از لام (هموسیتومتر -Hemocytometer) (نئوبار اصلاح شده -Improved Neubauer counting chamber) می باشد. علت این امر این است که سلول ها بصورت واقعی مشاهده شده و تفکیک آنها از ذرات گرد و غبار و غیرسلولی، امکان پذیر بوده و این ذرات دیگر به عنوان سلول شمارش نمی شوند.
لام نئوبار معروف ترین، دقیق ترین و متداول ترین لام هماسیتومترمی باشد. این لام، حالت دو طرفه داشته و در هر سمت آن یک محفظه شمارش سلولی به شکل مکعب مربع و به ابعاد mm 0.1 × ۳× ۳ وجود دارد. این محفظه خود به یک مربع ۳ × ۳ با مجموع ۹ مربع به ابعاد mm 3× ۳ و عمق mm 0.1 تقسیم می شود که بعد از گذاشتن لامل سنگی، حجم یک مربع آن به ۰.۱ میلیمتر مکعب می رسد.
به چهار مربع گوشه، مربع های WBC و به مربع وسط، مربع RBC گفته می شود. جهت سهولت در شمارش دستی سلول های خونی، هر کدام از ۹ مربع به ۱۶ مربع مساوی تقسیم می شوند که حجم هر کدام معادل ۰.۰۰۶۲۵ میلیمتر مکعب می باشد. (۰.۲۵× ۰.۲۵ × ۰.۱)
در لام نئوبار اصلاح شده، ناحیه مرکزی یا همان مربع ،RBC به ۲۵ مربع مساوی تقسیم شده است. یعنی هر ضلع مربع میانی که ۱ mm می باشد، به ۵ قسمت تقسیم شده و بنابراین طول هرکدام ۰.۲ mm و حجم هر یک از آن ها، ۰.۰۰۴ = ۰.۱ × ۰.۲ × ۰.۲ mm3 خواهد بود.
هر کدام از این ۲۵ مربع نیز به ۱۶ مربع دیگر تقسیم می شوند. در نهایت مربع میانی دارای ۴۰۰ مربع کوچک خواهد بود که طول هر کدام، ۰.۰۵ mm و حجم هر یک از آن ها، ۰.۰۰۰۲۵ mm3 خواهد بود.
- هموسیتومتر از مربع های بزرگ گوشه ای (Aو Bو Cو D) جهت شمارش گلبول های سفید استفاده می شود.
- از پنج مربع آبی در مرکز، جهت شمارش گلبول های قرمز یا پلاکت ها، و از ۱۰مربع سبز+آبی جهت شمارش پلاکت ها استفاده می شود.
- در واقع هر یک از ۲۵مربع در یک میلیمتر مربع مرکزی، در درون خود ۱۶مربع کوچکتر جهت تسهیل شمارش دارند.
- شکل پایین، نمای کناری محفظه شمارش همراه با پوشش شیشه ای روی هموسیتومتر را نشان می دهد.
شمارش سلول ها بصورت غلظت یا تعداد سلول ها در واحد حجم بیان می شود. از آنجا که محفظه هموسیتومتر ابعاد خطی دارد، واحد حجم بصورت میلیمتر مکعب گزارش می شود. اگرچه هماهنگی در متون پزشکی در مورد استفاده از واحدهای مرسوم در برابر استفاده از سیستم بین المللی واحدها (SI) وجود ندارد، ولی ICSH توصیه می کند واحد حجم بصورت لیتر گزارش شود:
RBCs: | ۵×۱۰۶/mm3 = 5×۱۰۶/μL = ۵×۱۰۱۲/L |
جدول یک: واحدهای اندازه گیری SI در هموسیتومتر
هموسیتومتر و لامل سنگی پس از هر بار استفاده باید بلافاصله با آب گرم شسته شده و با پارچه تمیز بدون پرز، پاک و در هوا خشک شود. سطح این لام نباید با گاز یا پارچه زبر تماس داده شود، زیرا باعث خراشیدگی خطوط روی لام می شود.
لازم به ذکر است که شمارش دستی سلول های خونی با هموسیتومتر دارای خطامی باشد که میتوان با تکرار حداقل ۳ باره آزمایش CBC به روش دستی، میزان خطا را تا حدود بالایی کاهش داد.
شمارش گلبول های قرمز
برای شمارش گلبول های قرمز، از محلول هایی استفاده می شود که هم خاصیت ایزوتونیک و هم خاصیت رقیق کنندگی داشته باشند. این محلول ها منجر به لیز سلول های خونی نمی شوند. محلول های مورد استفاده برای شمارش دستی سلول های خونی (ویژه گلبول های قرمز) عبارتند از:
محلول Hyme | محلول Gower | محلول Toison | |||
۵ گرم | سولفات سدیم | ۱۲.۵ گرم | سولفات سدیم | ۸ گرم | سولفات سدیم |
۰.۵ گرم | کلرورجیوه(مرکوریک) | ۳۳.۳ میلی لیتر | اسیداستیک گلاسیال | ۰.۵ گرم | کلرورجیوه(مرکوریک) |
۱ گرم | کلرور سدیم | ۲۰۰ میلی لیتر | آب مقطر | ۳۰ میلی لیتر | گلیسرول |
۲۰۰ میلی لیتر | آب مقطر | ۱۶۰ میلی لیتر | آب مقطر | ||
جدول دو: مححلول های شمارش دستی سلول های خونی (گلبول های قرمز)
در برخی موارد مانند هایپرگاماگلوبولینمی، استفاده از محلول هایم باعث رسوب پروتئین، ایجاد رولو و آگلوتیناسیون RBC می شود. در این گونه موارد، استفاده از محلول گاور توصیه می شود زیرا که اسیداستیک موجود در آن، از ایجاد رولو و همچنین آگلوتیناسیون گلبول های قرمز، جلوگیری می کند.
بجز محلول های فوق، محلول ابداعی لوئیس-دیسی (LD) نیز وجود دارد که از ۱ mL فرمالین، ۹۹ mL سیترات سدیم %۳ و ۹۰۰ mL آب مقطر تشکیل شده است. این محلول بایستی دور از نور آفتاب و در شیشه های قهوه ای رنگ نگهداری شود. به علت وجود فرمالین، نیازی به استریل کردن ندارد. طول عمر مفید این محلول، سه هفته بوده و استفاده بیش از این مدت با نتایج مطلوبی همراه نخواهد بود.
RBCها در محلول LD حالت مقعرالطرفین خود را حفظ کرده و خودبخود آگلوتینه نمی شوند. همچنین این محلول باعث می شود تا سلول ها به هم متصل نشده و تا چند ساعت پس از رقیق کردن خون با آن، سوسپانسیون سلولی پایدار بوده و RBC های آن سالم باقی می مانند.
در صورتی که بیمار مبتلا به اتوآگلوتیناسیون و یا آگلوتیناسیون سرد باشد، بهتر است محلول رقیق کننده بدون فرمالین استفاده کنیم، زیرا که خود فرمالین باعث تثبیت ذرات آگلوتینه شده و حتی با مخلوط کردن سوسپانسیون از هم جدا نمی شوند.
نحوه شمارش
در صورت استفاده از ملانژور قرمز جهت شمارش گلبول های قرمز، خون EDTA دار را تا درجه ۰/۵ ملانژور کشیده، اطراف وک ملانژور را با پنبه یا گاز تمیز پاک کرده، درون محلول رقیق کننده قرار داده و تا درجه ۱۰۱ آن را پر می کنیم. رقت بدست آمده ۲۰۰/۱ خواهد بود.
لامل سنگی را بر روی لام نئوبار قرار داده و قطره کوچکی از سوسپانسیون تهیه شده را بین لام و لامل قرار می دهیم.
سوسپانسیون طبق خاصیت موئینه در بین لام و لامل پخش می شود. ۵دقیقه فرصت می دهیم تا تمامی سلول های سوسپانسیون در یک سطح قرار بگیرند. عمل پر کردن چمبر بایستی یکباره و در یک نوبت صورت بگیرد. از پر کردن بیش از اندازه محفظه شمارش و همچنین ایجاد حباب جلوگیری شود.
برای شمارش از مربع وسط که بهترین انتشار سلولی را دارد، استفاده می کنیم. نحوه شمارش نیز به این صورت است که در مربع وسط، سلول های موجود در چهار مربع کناری و همچنین مربع مرکزی را شمارش کرده که در واقع یک پنجم کل مساحت مربع وسط را شامل می شود (۸۰ مربع از ۴۰۰ مربع).
بنابراین نتیجه حاصله را در عدد ۵ ضرب کرده و به عنوان شمارش سلول های یک مربع ۱×۱×۰/۱ mm3 در نظر می گیریم. با دخالت دادن میزان رقت سوسپانیون (۲۰۰/۱) و همچنین عمق محفظه شمارش (mm 0.1) نتیجه نهایی از طریق زیر محاسبه خواهد شد:
فاکتور رقت × فاکتور عمق ×۵ × تعداد سلول های ۵ مربع وسط = تعداد RBC در هر میکرولیتر
معمولاً فاکتور رقت و فاکتور عمق برای همه یکسان بوده و بنابراین می توان فرمول فوق را در نهایت به این شکل ساده نمود:
RBCs/µL = N×۱۰۰۰۰
لازم به ذکر است که در افراد آنمیک، از رقت ۱۰۰/۱ برای شمارش گلبول های قرمز استفاده می شود.
منابع خطا
خطاها ممکن است بخاطر ماهیت نمونه، تکنیک فرد انجام دهنده و تجهیزات غیردقیق باشد. خطاهای مربوط به توزیع سلول ها در هموسیتومتر، خطاهای میدان (Field errors) نامیدهمی شوند که با شمارش تعداد سلول های بیشتر، میتوان این نوع خطا را کاهش داد.
- خطاهای ناشی از ماهیت نمونه: وجود لخته های ریز در نمونه، بخاطر تغییراتی که در توزیع سلول ها یا کاهش تعداد آنها ایجاد می کند، سبب خطامی شوند. همچنین مخلوط نکردن کافی خون پیش از تهیه رقت و همچنین پس از تهیه رقت با مارکانو موجب خطا شده که میان آن به درجه رسوب سلول ها بستگی دارد.
- خطاهای ناشی از فرد انجام دهنده: شامل خطا در رقیق کردن، پر کردن محفظه شمارش و زمان شمارش می باشند.
- خطاهای مربوط به تجهیزات: استفاده از تجهیزات غیراستاندارد، هموسیتومتر خش دار و غیره.
- خطاهای ذاتی یا خطای میدانی: که ناشی از توزیع نامناسب سلول ها در مربع های شمارش هموسیتومتر است. همانگونه که قبلاً ذکر شد، با شمارش تعداد بیشتری سلول، میتوان این خطا را کاهش داد.
- لکوسیتوز شدید.
شمارش دستی گلبول های سفید
یکی دیگر از کاربردهای شمارش دستی سلول های خونی، شمارش گلوبول های سفید می باشد. در این جا برخلاف شمارش دستی گلبول های قرمز که از محلول های رقیق کننده استفاده می شده، به علت تعداد بسیار زیاد گلبول های قرمز در مقایسه با گلبول های سفید، از محلول های لیز کننده استفاده می کنیم. دو محلول عمده مورد استفاده عبارتند از:
اسیداستیک گلاسیال | ۳ mL | محلول تورک |
کریستال ویوله %۱ | ۱ mL | |
آب مقطر | ۱۰۰ mL | |
اسیداستیک گلاسیال | ۱۱ mL | محلول مارکانو |
بلودومتیلن | ۵۰ mg | |
آب مقطر | ۲۰۰ mL |
جدول سه: محلول های شمارش دستی سلول های خونی (گلبول های سفید)
این محلول ها باعث لیز گلبول های قرمز و رسوب لاشه سلولی آن ها در کنار پلاکت ها شده و در نتیجه یک سوسپانسیون خالص از گلبول های سفید ایجاد می شود. به این محلول ها، رنگ کریستال ویوله و یا بلودومتیلن نیز اضافه می شود تا دیدن هسته سلول ها آسان تر شود. کریستال ویوله باعث ایجاد رنگ آبی روشن در محلول شمارش می شود.
جهت شمارش گلبول های سفید، خون را تا خط ۰.۵ ملانژور سفید کشیده و محلول رقیق کننده را تا خط ۱۱ ملانژور پر می کنیم. رقت بدست آمده ۲۰/۱خواهد بود. در صورت لکوپنی از رقت ( ۱۰/۱ ملانژور سفید، خون تا خط ۱و محلول تا خط )۱۱ و در صورت لکوسیتوز از رقت ( ۱/۱۰۰ ملانژور قرمز، خون تا خط ۱ و محلول تا خط ۱۰۱) استفاده می کنیم.
پس از پر کردن محفظه شمارش لام نئوبار، عملیات شمارش را در چهار مربع بزرگ کناری آغاز می کنیم. فرمول نهایی محاسبه تعداد گلبول های سفید به صورت زیر خواهد بود:
فاکتور رقت (۲۰) × فاکتور عمق (۱۰) × میانگین سلول های شمارش شده = تعداد گلبول های سفید در هر میکرولیتر
به عبارت ساده تر:
۲۰۰ × میانگین شمارش شده = تعداد گلبول های سفید در هر میکرولیتر
و در صورتی که به جای میانگین، از مجموع شمارش سلول ها استفاده شود:
WBCs/µL = N × ۵۰
منابع خطا همانند شمارش دستی گلبول های قرمزمی باشد.
لازم به ذکر است که NRBCها با محلول مارکانو لیزنمی شوند و در هموسیتومتر با بزرگنمایی مربوط به شمارش لکوسیت ها، از WBCها قابل افتراق نیستند. بنابراین در هنگام شمارش افتراقی گلبول های سفید از روی گستره رنگآمیزی شده، میزان شمارش گلبول های سفید باید تصحیح شود:
شمارش دستی پلاکت ها
از روش های شمارش دستی سلول های خونی، شمارش پلاکت ها است. برای شمارش دستی پلاکت ها از محلول %۱ اگزالات آمونیوم (به محلول بریکر-کرانکیت نیز معروف است.) استفاده می شود (g 1.1 اگزالات آمونیوم در ۱۰۰ mL آب مقطر).
این محلول موجب تخریب گلبول های قرمز و سفید شده و در صورت پایین بردن کندانسور میکروسکوپ، پلاکت های رقیق شده با اگزالات آمونیوم به صورت ذرات کوچک درخشان دیده خواهند شد. محلول اگزالات آمونیوم تکه های غشای گلبولی را از بین نمی برد و ممکن است این لاشه های سلولی در زیر میکروسکوپ با پلاکت اشتباه شوند.
از آنجایی که پلاکت ها ساختاری گرانولار، درخشش ارغوانی و ظاهری گرد تا دندریتیک دارند، بنابراین با کمی مهارت می توان آن ها را از لاشه های سلولی تفکیک داد.
محلول اگزالات آمونیوم به مدت طولانی پایدار نبوده و در صورت نگهداری طولانی مدت، احتمال آلوده شدن آن با ذرات گرد و غبار و باکتری نیز وجود دارد. بنابراین در هر نوبت، بایستی به میزان مصرف چند روزه ساخته شود تا این محلول همواره تازه ساخت باشد.
باکتری ها به راحتی قادر به رشد در درون محلول اگزالات آمونیوم بوده و جالب اینکه همانند پلاکت ها درخشش دارند. از این رو بعد از تهیه محلول رقیق کننده، آن را با میکروفیلترهای مخصوص µ ۰.۲۲ پالایش نموده و در ۴ درجه نگهداری می کنیم. این فیلترها با حذف تمامی باکتری ها و گرد و غبار، حتی باعث استریلیزاسیون میکروبی محلول اگزالات نیز می شوند.
نحوه شمارش
همانند RBC، از ملانژور قرمز برای رقیق سازی و شمارش پلاکت استفاده می کنیم. خون را تا درجه ۱ و محلول اگزالات آمونیوم را تا درجه ۱۰۱ ملانژور پر می کنیم. رقت بدست آمده ۱۰۰/۱ خواهد بود. پس از پر کردن محفظه شمارش، لام نئوبار را به مدت ۲۰-۱۵ دقیقه در مکانی ساکن قرار می دهیم تا پلاکت ها در چامبر بالا آمده و با اتصال به سطح تحتانی لامل سنگی، همگی در یک سطح قرار بگیرند.
از آنجایی که این فرآیند طولانی بوده و ممکن است سوسپانسیون بین لام و لامل تبخیر شود، لام نئوبار را در یک پتری دیش حاوی پنبه مرطوب قرار می دهند تا شرایط تبخیر به حداقل خود برسد. همانند شمارش گلبول های قرمز، شمارش پلاکت نیز در ۵ مربع از مربع بزرگ میانی لام نئوبار صورت می گیرد (چهار مربع کوچک کناری و مربع مرکزی). سپس:
فاکتور رقت (۱۰۰) × فاکتور عمق (۱۰) × ۵ مجموع پلاکت شمارش شده = تعداد پلاکت در هر میکرولیتر
و بطور خلاصه:
Platelet/µL = N×۵۰۰۰
در برخی از کتب مرجع، شمارش پلاکت در دو طرف لام نئوبار و در مجموع در ۱۰ مربع توصیه می شود که در این صورت میزان شمارش شده را بایستی در عدد ۲۵۰۰ ضرب نمود. در صورتی که تعداد پلاکت ها در کل مربع بزرگ مرکزی شمارش شود، تعداد شمارش شده را در عدد ۱۰۰۰ ضرب خواهیم کرد.
برای حذف خطای میدان، شمارش حداقل ۱۰۰ پلاکت الزامیمی باشد. چنانچه تعداد شمارش شده کمتر از ۱۰۰ عدد باشد، مربع های بیشتری باید شمارش شوند، برای مثال ۲۵ خانه کوچک در یک طرف یا دو طرف چامبر. چنانچه باز هم تعداد شمارش شده در ۵۰ مربع، کمتر از ۱۰۰ باشد، نمونه ۱۰/۱ یا ۲۰/۱ رقیق می شود.
مقدار CV برای مجموع خطاهای میدان، پیپتینگ و خطای چامبر، برای شمارش حداقل ۱۰۰ پلاکت، ۱۱%می باشد.
تخمین شمارش سلول ها از روی گستره خون محیطی
برای تخمین شمارش گلبول های سفید و پلاکت ها از روی لام، به گستره ای با پخش منظم سلول ها در خون EDTA دار نیاز است.
برای شمارش تقریبی پلاکت، ۱۰ میدان با عدسی ۱۰۰ (Oil immersion) در مناطقی که پخش یکنواخت گلبول قرمز وجود دارد، انتخاب کرده و پلاکت های هر میدان را شمرده و میانگین بدست آمده را در عدد ۲۰۰۰۰ ضربمی کنیم.
انتخاب میدان ها براساس شمارش گلبول قرمز بیمار صورت می گیرد. بطور مثال اگر شمارش گلبول قرمز بیمار ۶ میلیون در میلیمتر مکعب باشد، شمارش پلاکتی در میدان های ۳۰۰ تایی و اگر ۵ میلیون باشد، در میدان های ۲۵۰ تایی و اگر ۴ میلیون باشد، در میدان های ۲۰۰ تایی صورت می گیرد تا ضریب ۲۰۰۰۰ تعداد را در میلیمتر مکعب محاسبه کند.
برای تخمین شمارش گلبول های سفید، میانگین شمارش گلبول های سفید در ۱۰ میدان با عدسی ۴۰ که در آن پخش یکنواخت گلبول های قرمز وجود دارد، را محاسبه کرده و حاصل در عدد ۲۰۰۰-۱۵۰۰ ضرب می شود.
شمارش رتیکولوسیت (Reticulocyte count)
رتیکولوسیت ها، گلبول های قرمز بدون هسته و نارسی بوده که دارای اسید ریبونوکلئیک (RNA) می باشند. (nRBC) در مرحله اورتوکرومیک با بیرون راندن هسته به رتیکولوسیت تبدیل می شود. این سلول ها در شرایط طبیعی، ۳-۲ روز در مغزاستخوان باقی مانده، یک روز هم در جریان خون هستند و پس از آن به گلبول قرمز بالغ تبدیلمی شوند.
بقایای RNA سیتوپلاسمی و ارگانل هایی مانند ریبوزوم و میتوکندری در رتیکولوسیت دیده می شود. حدود ۲۰% هموگلوبین در این مرحله سنتز می شود. از شمارش رتیکولوسیت ها برای تعیین فعالیت سنتز گلبول های قرمز در مغز استخوان استفاده می شود و بنابراین شمارش آنها تخمینی خواهد بود از سرعت تولید گلبول های قرمز و نه تخریب آن ها.
نحوه انجام آزمایش CBC به روش دستی
خون کامل EDTA دار با یکی از رنگ های حیاتی مانند نیومتیلن بلو (New methylene blue) یا بریلیانت کرزیل بلو (Brilliant cresyl blue) مجاور می شود.
برای تهیه این رنگ ها، یک گرم از آن ها را در ۱۰۰ میلیلیتر بافر فسفاته (PBS) با pH=7.4 حل کرده و در ظروف تیره و در دمای یخچال نگهداری کنید. رنگ ساخته شده در دمای یخچال به مدت یکماه قابل نگهداری است. دقت شود که قبل از استفاده از رنگ، آن را بوسیله کاغذ واتمن شماره یک، فیلتر کنید.
حجم های مساوی از خون را با یکی از رنگ های حیاتی مخلوط کرده و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. رنگ های حیاتی با عبور از غشاء گلبول های قرمز در حالت زنده، روی ریبوزوم ها و رشته های RNA موجود در رتیکولوسیت ها رسوب کرده و آن ها را به رنگ آبی سیر بصورت رسوبی از گرانول یا فیلامنت، قابل مشاهده می سازد.
دو لام تهیه کرده و پس از خشک شدن، با استفاده از عدسی روغنی، به شمارش رتیکولوسیت ها در مناطقی که پخش یکنواختی از سلول ها وجود دارد، می پردازیم. گلبول های قرمز آبی کمرنگ یا آبی متمایل به سبز و رتیکولوسیت ها آبی کمرنگ به همراه موارد رشته ای یا گرانولار به رنگ آبی تیره دیدهمی شوند.
حداقل ۱۰۰۰ گلبول (گلبول قرمز و رتیکولوسیت) شمارش می شود و سپس درصد رتیکولوسیت ها را محاسبهمی کنیم. برای مثال اگر ۱۵ رتیکولوسیت در بین ۱۰۰۰ گلبول شمارش شوند، شمارش رتیکولوسیت ۱.۵% خواهد بود. برای افزایش دقت، فرد دیگری، اسلاید دیگری از همان بیمار را بررسی کند که اختلاف جواب ها در محدوده ۲۰% قابل قبول خواهد بود.
با قرار دادن دیسک میلر در قسمت عدسی چشمی، دو مربع در میدان دید ظاهرمی شوند که یک مربع نه برابر مربع دیگر بوده و از این طریق، برآورد سریعی از تعداد گلبول های قرمز امکان پذیر می شود. در میدان های میکروسکوپی پشت سر هم، رتیکولوسیت ها را در مربع بزرگ و گلبول های قرمز را در مربع کوچک شمارش می کنند:
۱۰۰ × ((تعداد گلبول های قرمز در مربع کوچک × ۹)/(تعداد رتیکولوسیت ها در مربع بزرگ)) =رتیکولوسیت به درصد
مثال: اگر ۱۵۰ عدد RBC در چند میدان با پخش یکنواخت در مربع کوچک شمرده شده باشند و تعداد رتیکولوسیت های شمارش شده در مربع بزرگ، ۴۰ عدد باشد:
۳%= ۱۰۰ × ((۹ × ۱۵۰) / ۴۰) = Retic%
برای حصول اطمینان بیشتر، بهتر است حداقل ۳۰۰ گلبول قرمز در مربع کوچک شمارش شود. در اینصورت درصد رتیکولوسیت ها در بین حدود ۲۷۰۰ گلبول قرمز محاسبه شده و برآورد مناسب تری را منجر می شود.
شمارش مطلق رتیکولوسیت ها (Absolute Reticulocyte Count (ARC))
تعداد رتیکولوسیت ها در یک لیتر خون کامل را شمارش مطلق رتیکولوسیت می گویند.
میزان طبیعی رتیکولوسیت در بزرگسالان ۱.۵ – ۰.۵ % بوده و بنابراین شمارش مطلق طبیعی در بزرگسالان ۷۵-۲۵، میزان رتیکولوسیت در نوزادان شیرخوار ۶.۵ – ۲.۵ % بوده که تا اواخر هفته دوم زندگی، تا دامنه مرجع بزرگسالان، افت می کند. (واحد ۱۰ به توان ۹ بر لیتر)
اندکس تولید روزانه رتیکولوسیت (Reticulocyte Production Index (RPI))
رتیکولوسیت هایی که بصورت نارس از مغز استخوان به خون محیطی واردمی شوند، به عنوان رتیکولوسیت های تحت استرس (Shift Reticulocyte) شناختهمی شوند. رتیکولوسیت های تحت استرس، بجای اینکه در مدت ۱ روز در خون محیطی رشته های خود را از دست بدهند، این کار را در مدت ۴-۲ روز انجام می دهند، زیرا که زودتر از موعد مقرر وارد خون شده اند.
چنانچه در لام خون محیطی بیمار، سلول های پلی کرومازی یا گلبول های قرمز هسته دار در پاسخ به کمخونی شدید یافت شود، بایستی برای ارزیابی فعالیت روزانه مغزاستخوان فرد بیمار نسبت به شخص سالم، از اندکس RPI استفاده شود.
هنگامی که رتیکولوسیت بسیار نارس (آکنده از رشته های ریبوزم و ریبونوکلئیک اسید) بر اثر تحریک هورمونی از مغز استخوان وارد خون محیطی می شود، نسبت به حالت نرمال به زمان زیادتری برای بالغ شدن نیاز دارد. زمان بلوغ برای فردی با هماتوکریت ، %۴۵ یک روز است و هر ۱۰% که از میزان هماتوکریت کم شود، نصف روز به زمان بلوغ (Maturation Time (MT)) اضافه می شود:
%HCT | ۴۰-۴۵ | ۳۵-۳۹ | ۲۵-۳۴ | ۱۵-۲۴ | <15 |
Maturation Time | ۱.۰ | ۱.۵ | ۲.۰ | ۲.۵ | ۳.۰ |
جدول چهار: زمان بلوغ رتیکولوسیت در آزمایش CBC به روش دستی
با توجه به جدول بالا، شاخص تولید رتیکولوسیت از طریق فرمول زیر محاسبه می شود:
RPI= %Retic [(Patient)*HCT(Patient)]/[HCT(normal)*MT]
مثال: چنانچه درصد شمارش رتیکولوسیت فردی، ۷.۸% و هماتوکریت وی ۳۰% باشد:
RPI= (7.8 × ۳۰) / (۴۵ × ۲) = ۲.۶
عدد بدست آمده بدین مفهوم است که مغز استخوان این بیمار، ۲.۶ برابر فرد نرمال فعالیت اریتروپوئز دارد.
از آنجایی که تعداد کمی از رتیکولوسیت های واقعی شمارشمی شوند، خطای نمونه برداری در شمارش دستی رتیکولوسیت ها تا اندازه ای زیاد است. حدود اطمینان ۹۵% برای شمارش، به شکل زیر بیان شود:
که در اینجا ،Rشمارش رتیکولوسیت به درصد و Nتعداد گلبول های قرمز مورد ارزیابی است.
این بدین معنی است که چنانچه تنها ۱۰۰۰ گلبول قرمز شمارش شوند، حدود اطمینان برای شمارش رتیکولوسیت %۱ در محدوده، ۱.۶ – ۰.۴ % برای رتیکولوسیت %۵ در محدوده، ۴.۶ – ۳.۶ % و برای شمارش رتیکولوسیت ۱۰% در محدوده ۱۱.۹ – ۸.۱ %می باشد.
نکات مهم در رنگ آمیزی و شمارش رتیکولوسیت
- نمونه خون بایستی تازه باشد و حداکثر ۸-۶ ساعت از نمونه گیری آن در دمای اتاق گذشته باشد. زیرا با گذشت زمان رتیکولوسیت ها ممکن است به RBC تبدیل شوند. ICSH توصیه می کند که تعیین میزان رتیکولوسیت بلافاصله پس از نمونه گیری صورت بگیرد.
- خون بیمار بایستی هموژن بوده و به خوبی مخلوط شود تا رتیکولوسیت ها در نمونه خون بصورت یکنواخت و مناسب پخش شوند. بعد از رنگ آمیزی و انکوباسیون و قبل از تهیه گستره نیز نمونه خون بایستی به خوبی مخلوط شود.
- رنگ آمیزی رتیکولوسیت نیازی به فیکساسیون ندارد.
- خشک شدن سریع گستره رنگ شده برای بهبود وضوح تصویر سلول ها توصیه می شود. خشک شدن آهسته و ضعیف گستره و وجود رطوبت در لام، باعث ایجاد آرتیفکت های رفلکس دار و براق (مشابه واکوئل) در سطح سلول ها می شود که گاهی به علت شباهت به رتیکولوم های رسوب کرده در سلول، به عنوان رتیکولوسیت شمارش می شوند.
- به چنین سلول هایی که در اثر رطوبت ایجاد می شوند، Torocyte گفته می شود.
- در صورت کار کردن با پیچ میکرو در میکروسکوپ، بدلیل براق بودنشان به راحتی از رتیکولوسیت ها قابل تفکیک هستند.
- در نمونه های آنمیک بجای برداشت ۱۰۰µ خون، از حجم ۱۵۰µ و در نمونه های پلی سایتمیک از حجم ۵۰µ استفاده می شود.
- انکوباسیون طولانی تر از مقدار استاندارد، باعث رسوب غیراختصاصی رنگ بر روی RBCها شده و به اشتباه رتیکولوسیت شمارش می شوند.
- رنگ آمیزی با نیومتیلن بلو گرانول های آبی پررنگ تر و هموژن تری را در مقایسه با بریلیانت کرزیل بلو و ایجاد می کند و بنابراین از اولویت بالاتری برخوردارمی باشد.
- رتیکولوسیت ها را بایستی از اجسام پاپن هایمر، هاینز بادی، هاول ژولی و گلف بال های آلفاتالاسمی افتراق داد.
مقادیر مرجع برای شمارش سلول های خونی
در دو جدول زیر مقادیر مرجع برای آزمایش CBC به روش دستی جنس مذکر و مونث آمده است.
Perfect Precision in Manual Cell Counting (chemometec.com)
Manual vs automated cell counting, is there a great divide? | CytoSMART
l25_c_met_complete_blood_count.pdf (cdc.gov)
ویکی پدیا
آزمایشگاه رفرانس قم
I have been exploring for a little bit for any high quality articles or weblog posts in this sort of space . Exploring in Yahoo I at last stumbled upon this website. Reading this info So i am happy to exhibit that I have an incredibly excellent uncanny feeling I found out exactly what I needed. I most definitely will make certain to don?t omit this web site and provides it a glance on a relentless basis.
.Thank you for your positive opinion
تستا – شرکت توسعه سلامت توان آفرین
سلام
عالی بود
سلام
عالی بود. کامل و جامع. ممنون
سلام
از توجه و نظر لطف شما سپاسگزار هستیم.
تستا – شرکت توسعه سلامت توان آفرین